酶标记抗体
酶标抗体技术原理
酶标抗体技术原理酶标抗体技术（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的免疫分析技术，用于检测和定量特定抗原或抗体的存在。
ELISA的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA 等几种不同的变体，但它们都遵循相似的基本步骤和原理：1.固定抗原：首先，在实验容器（如酶标板）的表面上固定特定抗原。
这可以通过将抗原直接吸附在容器表面上或使用化学交联剂来完成。
2.样品处理：样品（可能含有待检测抗原或抗体）与固定抗原接触，使待检测物质与抗原结合。
这样，如果待检测的是抗原，那么抗原将与固定的抗体结合；如果待检测的是抗体，那么抗体将与固定的抗原结合。
3.第一次抗体结合：添加与待检测物质特异性结合的第一次抗体。
这个抗体会与样品中的待检测物质结合，形成抗原-抗体复合物。
4.第二次抗体结合：添加与第一次抗体特异性结合的酶标记的第二次抗体。
这个酶标记的抗体将与第一次抗体结合，形成一个二抗-一抗-抗原复合物。
5.酶标记物检测：加入适当的底物，使酶标记的第二次抗体产生染色反应。
底物的选择取决于所使用的酶标记，常见的酶标记有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）。
产生的染色反应可以通过光密度测量仪（spectrophotometer）进行定量测量。
6.结果分析：根据染色反应的强度，可以确定待检测物质的存在和浓度。
一般来说，反应的光密度与待检测物质的浓度成正比。
通过酶标抗体技术，可以检测和定量多种抗原或抗体，广泛应用于医学诊断、药物研发、免疫学研究等领域。
酶标记抗体
酶标记抗体酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一)酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体的方法
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所
获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重
大损失，是目前最常用的方法。
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的
酶与蛋白质结合。
4. 试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，
(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿
色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前
者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺
酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，
2. 标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分
钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅
第八章酶免疫技术
酶放大免疫分析技术 示意图
克隆酶供体免疫分析示意图
克隆β-D半乳糖苷酶的两种片段： 酶受体（EA）和酶供体（ED）
二、异相酶免疫测定
与均相不同 之处
需分离游离与结合的酶标记物
分类：液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
Ag+Ab-E
AgAb-E+Ab-E
物、激素等）
1、已知抗体包 被于载体表面
1、已知抗体包 被于载体表面
+
竞争法测抗原
-
E
E
E
3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱
E
E
E
2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合
2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合
E
E
3、加酶作用 的底物显色
ELISA检测抗体的方法
间接法
方法
用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗 抗体或二抗）加底物显色。
底物显色
1、固相化抗人 IgM 2、加待测物 特异性IgM与 非特异性IgM 和抗人IgM结合
1、固相化抗人 IgM
2、加待测物 只有非特异性IgM 和抗人IgM结合
3、加特异性 抗原，与特异 性抗体结合
E E E
3、加特异性抗 原，不能与非 特异性IgM结合
+
E
E
4、加酶标抗体 与特异性抗原结 合，加底物显色
原理
酶标记物与相应的抗原或抗体结合后， 标记酶的活性会发生改变，不用分离结合 和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性 的改变，而确定抗原或抗体的含量。
均相酶免疫测定
最具代表性的两种技术
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法的比较原理
抗体标记方法是实验室中常用的技术手段，用于检测和定位特定分子或细胞的存在和分布。
常见的抗体标记方法包括荧光标记、酶标记和放射性标记。
这些方法的比较原理如下：
1. 荧光标记：荧光标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，在荧光显微镜下显示特定波长的光信号。
这种标记方法具有高灵敏度、高特异性和多色标记的优势，使其广泛应用于细胞和组织的免疫染色、流式细胞术和光学显微镜观察等。
然而，荧光标记方法对光照条件和荧光物质的稳定性有一定要求，且荧光信号容易受到组织自身荧光的干扰。
2. 酶标记：酶标记方法利用被标记抗体结合目标分子后，通过酶的催化作用来产生显色或荧光信号。
最常用的酶标记方法是辣根过氧化物酶（HRP）标记和碱性磷酸酶（AP）标记。
酶标记方法具有较高的灵敏度和稳定性，适用于免疫组化和免疫印迹等实验。
然而，酶标记对显色反应的条件要求严格，且显色或荧光信号不易于定量。
3. 放射性标记：放射性标记方法利用放射性同位素标记抗体，通过射线的衰变来检测目标分子。
放射性标记方法具有极高的灵敏度和定量性，适用于放射免疫测定等实验。
然而，放射性标记需要较复杂的实验操作和设备，同时存在一定的安全风险。
综上所述，选择适当的抗体标记方法应根据实验需求和目标分子的性质来决定，综合考虑灵敏度、特异性、稳定性、定量性和安全性等因素。
标记抗体技术
标记抗体技术免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。
常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。
目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。
一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ）HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。
酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob. 辣根过氧化物酶标记方法酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。
过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。
后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。
游离酶理论上不影响最终的显色。
但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。
因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。
纯化的方法很多，硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想。
用离子交换层析、分子筛法可得到最佳的分离效果，但费用较贵。
酶标记抗体
酶标记抗体
产品概述：
酶标记抗体,是一类广泛用于生物学和医学科学的许多领域，具有高特异性、高敏感性和安全的免疫化学试剂。
目前较为常用的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体就是其中的一种，它是经过化学方法将辣根过氧化物酶（HRP）标记在抗体IgG分子上而制成的HRP－抗体结合物。
我公司向用户提供的各类辣根过氧化物酶标记产品均为本公司自主研发的产品，HRP 购于美国SIGMA公司的产品，根据本公司建立的目前较先进的过碘酸钠氧化法标记技术而成。
每种成品已加入一定浓度的BSA作为稳定剂。
产品的工作浓度根据方法不同而别，用前最好-20℃冻存，避免反复冻融。
应用范围：
应用于抗原决定族的抗原性分析鉴定，各种抗原、抗体的定量、定性及定位分析测定等。
工作中应注意的问题：
1、包被抗体或抗原不适，易产生阳性值较小，或产生变异，即跳管现象。
2、用抗血清不纯化，或纯化程度太低的抗体包被，则阳性值较小，或没有阳性梯度。
3、封闭不好或标记物过浓可产生对照较高。
主要性能：
每只0.1ml液体，内含IgG约1mg/ml，1% BSA，0.01%庆大霉素。
-20℃保存，稳定期一年。
4℃保存约3～6个月，4℃可30天左右。
稀释液为：0.01mol/L pH7.4PBST。
工作效价：
ELISA法：1：5000～10000
免疫印迹法：1：500～5000。
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酶标记抗体酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。
酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。
酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。
酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。
目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。
高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。
在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
(一)酶制剂及其底物凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。
但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。
目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。
HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。
酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。
HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。
RZ值越小，非酶蛋白就越多。
值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
酶促反应的过程如下:HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。
如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。
5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。
OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。
目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。
前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。
另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。
尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。
应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。
这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
(二)HRP标记抗体的方法酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。
对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。
尤以简易过碘酸钠法更为常用。
戊二醛二步法1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
2.标记步骤：(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。
流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。
如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。
放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7)3000rpm离心半小时，弃上清。
沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH 7.4的PBS中。
(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3.结果判定：(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。
然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。
最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。
(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml)IgG量(mg／ml) 酶量克分子比值＝────────÷───────＝─── × 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。
缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
4.试剂及器材：(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO449ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
(3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
(5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
简易过碘酸钠法本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。
后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。
HR P经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2.标记步骤:(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入1 0mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
(5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
3.结果判定：除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624.试剂及器材:(1)0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml加蒸馏水至2,000ml。
(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:Na２CO３0.32克NaHCO３0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4)NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
(三)工作浓度的选择在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。
因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。
另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。
因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。
酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。
然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。
以2M H２SO４0.05 ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。
并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。
由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。
这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。
(四)注意事项1.在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。