荧光免疫技术
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
荧光免疫技术
二、标记抗体的纯化
目的 去除未结合的游离荧光素
去除过度标记的蛋白 去除非特异反应抗体
方法
透析法 将标记物置于透析袋中透析；适 用于蛋白含量低的标记物 凝胶过滤法
常用Sephadex G50凝胶，洗脱第 一峰为结合蛋白峰，第二峰为荧光素 峰。
离子交换层析法 依次洗脱下来的成分是未结合荧 光素的抗体、荧光标记合适的抗体、
亮黄绿色 最广泛
桔红色 橙红色 常用于双重标记或 对比染色 衬染或单独染色, 荧光猝灭速度慢 与FITC一起用于 双色免疫荧光染色, 共用488nm波长
藻红色
其他荧光物质
镧系螯合物 如 Eu3+ 等
酶作用后产生荧光的物质
如: 4甲基伞酮-β-D半乳糖苷
β-半乳糖苷酶 4甲基伞酮
荧光免疫分析常用的仪器和设备
荧光偏振
P=
FH-FL FH+FL
P=0说明完全不偏振，-1<P<1为部分偏振
荧光物质
最大吸收 最大发射 波长(nm) 波长(nm) 异硫氰酸荧 490~495 520~530 光素(FITC) 570 595~600 四乙基罗丹 明(RB200) 550 620 四甲基异硫 氰酸罗丹明 (TRITC) 藻红蛋白 (R-RE) 565 578 名 称 荧光颜色 应 用
试剂
95% 乙醇、甲醇、丙酮、 10% 福 尔马林等。
二、荧光抗体染色
目的： 使荧光抗体与待观察的抗原
结合，达到示踪效果。
步骤：于已固定的标本上滴加经适
当稀释的荧光抗体，25~37℃湿盒 反应30分钟，用PBS洗涤，缓冲甘 油封片。
直接法
荧光标记抗体 抗原
间接法
荧光标记抗体 特异抗体 抗原
08第八章 荧光免疫技术
第八章
荧光免疫技术
一、CLSM的工作原理
激光束经照明针孔形成点光源，对标本内焦 平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探 测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管逐点 或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧 光图像。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
二、CLSM的参数
仪器的参数有：①物镜；②激光功率； ③激光扫描程度；④探测针孔；⑤光电倍增
换层析法;
(3)去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固
相抗原吸收。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
5. 荧光素标记抗体的鉴定 荧光素与蛋白结合率、抗体效价、抗体特
异性、抗体抗体特异性染色滴度。
6. 荧光记抗体的保存
加入0.1%NaN3或0.01%硫柳汞防腐，避免
反复冻融，-20℃冻存可保存1~2年，真空干燥 后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存。
以及生物素、抗生物素蛋白法免疫芯片、细胞免疫
芯片。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
1.液体芯片 一种免疫芯片与流式细胞术相结合的新技术。
将微小的乳胶颗粒（5.6um）用荧光染色的方法
进行编码，每种颜色的微粒代表一种检测标志物， 把针对不同检测物的彩色编码微粒混合后加入微 量病人标本，在悬液中靶分子与微粒进行特异性 地结合，通过激光流式仪判定后由电脑以数据信 息的形式记录下来。
人民卫生出版社
第八章
荧光免疫技术
FITC的衬比染色或双标记FAT， 也可单独采用 可与FITC共用488nm激发光双标 记FAT、流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 流式细胞术 DNA染色 双激光管的仪器分析 时间分辨荧光免疫测定
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介
免疫荧光技术(immunofluorescent technique)简介1、荧光免疫测定技术的概念将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。
2、技术分类（1）荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。
（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。
3、荧光的产生物质吸收外界能量而进入激发状态，在恢复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素。
由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术。
4、荧光素的荧光特性（1）停止供能，荧光现象随即终止。
（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性。
入射光波长<发射光波长。
（3）荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=---------------------------吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱。
5、常见荧光素及其特性（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光490~495nm，发射光520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
（2）RB200：橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
（3）TRITC：紫红色粉末，吸收光550nm，发射光620nm，橙红色荧光。
（4）镧系：Eu3+、Tb3+等。
（5）PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
（6）其它：酶作用后产生荧光物质，具体如下表：酶底物产物激发光发射光B-G MUG MU 360 450AP MUP MU 360 450HRP HPA 二聚体 317 4146、合适荧光素的选择（1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖ ���颉���S H H S H（2）荧光效率高，标记后下降不明显。
临床免疫学检验 课件 第8章 荧光免疫技术
3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
关于荧光免疫技术详细介绍
关于荧光免疫技术详细介绍荧光免疫技术是一种基于抗体-抗原反应原理的分析方法，利用荧光染料标记的抗体或抗原与靶标结合后，通过测量荧光信号的强度来检测和定量分析靶标物质。
荧光免疫技术的原理主要包括标记物准备、信号检测和结果分析三个方面。
首先，需要将抗体或抗原与荧光染料标记结合，一般通过共价键合、生物素-链霉亲和素体系或其他化学反应进行标记。
标记物的选择应该满足荧光发射波长范围广、发射光强、稳定性好等要求。
然后，标记物与待检测样品中的靶标物质结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，通过荧光检测仪器，测量荧光信号的强度，并将其转化为定量结果。
荧光免疫技术具有以下优势：首先，荧光信号强度大，可以实现高灵敏度的检测。
其次，荧光染料具有多样化的波长特性，可以实现多通道的同时测量。
此外，荧光免疫技术还具有选择性高、重复性好、灵敏度高、分析速度快、自动化程度高的特点。
荧光免疫技术在医学、生物学和环境监测等领域有广泛的应用。
在医学上，荧光免疫技术可以用于疾病的早期诊断和预防，如肿瘤标记物检测、感染病原体的检测和体液中特定蛋白质的定量等。
在生物学研究中，荧光免疫技术可以用于检测细胞和分子的定位、定量和相互作用等。
在环境监测中，荧光免疫技术可以用于检测污染物、重金属和有害物质等。
衡量荧光免疫技术的指标主要包括检测灵敏度、检测限、特异性、线性范围、准确性和重现性等。
检测灵敏度是指该技术能够检测到的最低浓度，一般以荧光信号的强度来表示。
检测限是指能够可靠地检测到的最低浓度，一般是指信号与噪声之间的差异。
特异性是指该技术与其他分子之间的交叉反应能力。
线性范围是指该技术在一定浓度范围内与浓度之间的线性关系。
准确性是指该技术的结果与真实值之间的接近程度。
重现性是指该技术在相同条件下的重复实验结果的一致度。
在实际应用中，荧光免疫技术还可以与其他技术相结合，如酶标记技术、化学发光技术等，以扩大分析范围和提高灵敏度。
同时，随着荧光探针和检测仪器的不断发展，荧光免疫技术将会不断创新和完善，为医学和生物科学研究提供更多的选择和便利。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
570～ 四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素 氨基Eu3+螯合物 550nm 490490-560nm 354nm 340nm
第二节 荧光抗体技术
荧光抗体技术的基本原理
荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应， 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗 涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测， 或对自身抗体进行定性和滴度测定。 或对自身抗体进行定性和滴度测定。
荧光抗体的制备
抗体的荧光素标 记
标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 标记原理: 利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 FITC 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 FITC结合成荧光抗体 标记方法: 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 荧光素用量少，但有非特异性染色。 短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低。 非特异染色较低。
二、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 荧光物质
常用的荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 最大吸收光谱 490～495nm 490～ 最大发射光谱 应用 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定 黄绿色） FAT、 520～ 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT 620nm（橙红色） 620nm（橙红色） 595nm（红色） 595nm（红色） 430nm（蓝色） 430nm（蓝色） 613nm FITC的衬比染色或双标 FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、 双标记FAT、流式细胞术 FAT 双标记或多标记FAT 双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
设立实验对照: 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 - ：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 ：荧光较弱但清楚可见。 ++”：荧光明亮。 “++ ：荧光明亮。 +++”：耀眼强荧光。 “+++ ：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 特异荧光强度“++ 以上判定为阳性，对照光应呈“ 或 。 以上判定为阳性 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 "++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
荧光抗体的制备
荧光抗体的纯化
去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除游离荧光素及其降解产物： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体： 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体： 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收
荧光抗体的制备长，在不同波长下记录的样 发射光谱是指固定激发波长， 是指固定激发波长 品发射荧光的强度。 品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长， 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 是指固定检测发射波长 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
滤光片
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间， 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过， 保护眼睛。 保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光： 透射光：照明光线从标 本下经聚光器透过标本 进入物镜。 进入物镜。 落射光： 落射光：照明光线从标 本上经垂直照明器落射 到标本， 到标本，经标本反射进 入物镜。 入物镜。 透射荧光显微镜光路(a) 透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b) 落射荧光显微镜光路(b)
stokes位移: stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差 位移 镧系元素Stokes位移大(273nm) Stokes位移大(273nm)， 镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱 和发射光谱不重叠
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
发射光谱和激发光谱
发射光谱带较窄：613nm±10nm， 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm， 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
荧光标记物的相对比活性
比活性： 比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量 荧光激发光源1000 /S激发 1000次 激发， 荧光激发光源1000次/S激发，比活性提高
时间分辨荧光免疫测定
基本原理
信号增强
Eu3+标记抗原 抗体复合物
酸性增强液
Eu3+解离
结合β 结合β-二酮体
-20℃：保存1～2年 20℃：保存1 真空干燥： 真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片： 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞： 培养细胞：单层培养细胞
荧光的基本知识
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下， 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、 消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、 20℃）、苯胺、 ）、苯胺 酚、硝基苯、I-等 。 硝基苯、
荧光的基本知识
荧光偏振
FH－FL P＝────── ＝ FH＋FL
第八章 荧光免疫技术
第一节 概述 一、荧光的基本知识 二、荧光物质
第二节 荧光抗体技术 一、标本的制作 二、荧光抗体的制备 三、荧光抗体染色与结果判断 四、荧光显微镜的基本结构 第三节 荧光免疫分析的类型 一、时间分辨荧光免疫测定 二、荧光偏振免疫测定 三、荧光酶免疫测定
第四节 荧光免疫技术在医学检验中的应用 一、荧光抗体技术的应用 二、荧光免疫测定的应用 思考题 小结
标本的制作
组织切片的类型
冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。 石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。
标本的制作
标本的固定和保存 标本的固定和保存
固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、 保 4℃、 存：4℃、-20℃
一、时间分辨荧光免疫测定
基本原理
时间分辨
自发荧光寿命短:1ns～ 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～ 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光
时间分辨检测原理示意图
时间分辨荧光免疫测定
基本原 理
stokes位移 stokes位移
四、荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
利用一定波长的激发光对 样品进行激发， 样品进行激发，产生一定波长 的荧光， 的荧光，对样品结构或其组分 进行定性、定位、 进行定性、定位、定量观察检 测。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 光源：高压汞灯、 滤光片：隔热、 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 光路：透射光、 聚光器：明视野、 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头： 镜头：消色差镜头
荧光素与蛋白结合率： 荧光素与蛋白结合率： F/P=
2.87 × A495nm A280 nm 0.35 × A495nm
抗体效价： 抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体抗体特异性染色滴度： 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
第一节 概 述
一、荧光的基本知识
荧光（fluorescence） 荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后， 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时， 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。 放出能量，称为荧光。
荧光的基本知识
均相荧光免疫测定
（homogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
非均相荧光免疫测定
（heterogeneous fluorescence immunoassay） immunoassay）
荧光免疫测定的方法类型
非均相荧光免疫测定： 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定