生物样品超薄切片技术
超薄切片名词解释
超薄切片名词解释
超薄切片技术是一种尖端的显微技术，能够揭示样品内部的微小结构和细胞形态。
通过将样品切成厚度小于100纳米的超薄切片，科学家们可以在高倍显微镜下观察到这些切片的内部结构和细胞活动。
这种技术以其高分辨率、高对比度和高清晰度的优点，成为了生物学、医学、材料科学等领域不可或缺的研究工具。
在生物学和医学领域，超薄切片技术发挥了重要的作用。
通过对细胞结构和功能的观察，科学家们可以深入了解疾病的发病机制、诊断方法和治疗策略。
例如，通过对肿瘤细胞的超薄切片观察，可以揭示肿瘤细胞的异常增殖和分化，为肿瘤的诊断和治疗提供重要的依据。
此外，超薄切片技术还可以用于研究神经元网络、免疫系统、心血管系统等复杂生物系统，帮助科学家们深入探究生命活动的奥秘。
在材料科学领域，超薄切片技术也被广泛应用于研究材料的微观结构和性能。
通过对材料的超薄切片观察，科学家们可以了解材料的晶体结构、相变行为、界面反应等重要信息，为新材料的研发提供重要的指导。
此外，超薄切片技术还可以用于研究材料的力学、光学、电学等性能，为材料的应用和优化提供重要的依据。
超薄切片技术是一种强大的科学研究工具，它能够提供对微小结构和细胞的深入了解，有助于推动科学研究的进展。
随着科技的不断发展，相信超薄切片技术将在未来的科学研究中发挥更加重要的作用。
超薄切片技术
半薄切片进行光学显微镜观察的目的：
(1) 定位：通过光学显微镜观察，确定所要观察 的范围，然后保留要用电镜观察的部分，修去 其余部分。
(2)便于对同一组织的同一部位进行光学显微镜和 电镜的对比观察。半薄切片定位以后，要对包 埋块作进一步的修整。通常将块的顶端修成金 字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度 为0.2mm～0.3mm。
3 脱水
为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必 须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和 水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用 的脱水剂是乙醇和丙酮。
急骤的脱水会引起细胞的收缩，因此，脱 水应梯度进行： 15% 乙醇15分钟，30%乙醇 15分钟，50%乙醇15分钟， 70% 乙醇15分钟， 85%乙醇15分钟，95%乙醇15分钟，100%乙醇 １0分钟(二次)。游离细胞可适当缩短脱水时间。 过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使 样品发脆，造成切片困难。
2.3常用固定剂有:
(1)四氧化锇 (OsO4)
是一种强氧化剂，与氮原子有较强的亲和 力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良 好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应 使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定 脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白 稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应， 但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化 锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定 的样品图象反差较好。锇固定的时间一般为 1-2小时。
2 固定
2.1 固定的目的 是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结
超薄切片样品制备的基本步骤
超薄切片样品制备的基本步骤
一、样品固定
超薄切片样品制备的第一步是对样品进行固定。
固定是为了使组织或细胞保持在自然状态，防止其在处理过程中发生自溶和腐败。
常用的固定方法有戊二醛固定法和锇酸固定法。
在固定过程中，要确保样品充分固定，以避免后续步骤出现问题。
二、样品包埋
固定后的样品需要用适当的介质进行包埋，以便于切片的制作。
包埋剂的选择应根据样品的性质和实验要求来决定。
在包埋过程中，要保证样品平整，无气泡，以免影响切片的制作。
三、切片制作
切片制作是超薄切片样品制备的关键步骤。
一般采用超薄切片机进行切片，得到厚度在50-100nm之间的超薄切片。
切片时要保证切片平整，无裂痕，无毛刺。
切好的切片需用蒸馏水冲洗，去除多余的介质。
四、染色处理
染色处理是为了使切片中的结构能够更好地显现出来。
常用的染色方法有免疫标记染色和重金属染色。
染色时要注意控制染色时间和浓度，以免造成过度染色或染色不足。
五、观察与成像
染色后的切片需在电子显微镜下进行观察和成像。
观察时要选择合适的放大倍数和观察条件，以便更好地观察到样品的结构特征。
成像时需注意控制曝光时间和亮度，以获得高质量的图像。
以上是超薄切片样品制备的基本步骤，每个步骤都需要严格按照操作规程进行，以保证制备出的样品质量可靠，满足实验要求。
第四章超薄切片技术
生物电子显微技术
4. 常用的脱水剂： 乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、 环氧丙烷、包埋剂的单体。
5. 脱水注意事项: ⑴ 脱水要彻底 ⑵ 更换液体动作要迅速 ⑶ 脱水时间不宜过长 ⑷ 固定后的 样品要充分漂洗
附加步骤：块染（Block Staining) 生物电子显微技术 块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色 叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）
2、理想固定剂
生物电子显微技术
1优）点锇：酸（OsO4)
⑴ 几乎和细胞内所有成分发生化学结合
⑵ 对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作
用良好
⑶ 可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物
⑷ Z=76，增加膜的反差 ⑸ 对磷脂蛋白、核蛋白保护很好
生物电子显微技术
锇酸缺点： ⑴ 不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对 微管固定效果差 ⑵ 酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究 ⑶ 分子量大,渗透能力差，要求组织块小 ⑷ 固定时间不宜过长 ⑸ 可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积 ⑹ 有挥发性、剧毒
c. 原位固定 d. 灌流固定
生物电子显微技术
固定操作示意图
生物电子显微技术
漂洗操作方法
3、固定注意事项：
生物电子显微技术
1) 固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%
浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀
浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋
白质分子氧化而断裂
2) 固定液的渗透压：
操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤)
⑴ 快：动作迅速,快取,投入固定液
⑵ 小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4
⑶ 冷：0～4℃
⑷ 准：取的部位准，有代表性、目的性
超薄切片技术原理课件
技术优势
高分辨率
超薄切片技术能够提供高分辨率的显 微图像，有助于更精确地观察细胞结 构和细节。
无损伤检测
超薄切片技术对样品损伤较小，可以 保持样品的完整性，尤其适用于珍贵 样本的分析。
广泛适用性
超薄切片技术适用于各种样品，包括 生物、医学、材料科学等多个领域。
高对比度
超薄切片技术能够提供高对比度的图 像，使得细胞结构和组分更易于区分 和识别。
药物研发
超薄切片技术可以用于药物作用机制的研究，通过观察药 物对细胞结构和功能的影响，有助于发现新的药物作用靶 点。
半导体工业领域应用
01
集成电路制造
在集成电路制造过程中，超薄切片技术用于对半导体材料进行微观结构
和缺陷分析，为优化制造工艺和提高芯片性能提供支持。
02
纳米材料制备
超薄切片技术能够将纳米材料切成厚度在数纳米至数十纳米之间，制备
供更多有价值的信息。
05
CATALOGUE
超薄切片技术实际应用案例
生物医学领域应用
细胞结构和功能研究
超薄切片技术能够将生物样本切成厚度在数十至数百埃米 的超薄切片，揭示细胞内部的精细结构，为研究细胞功能 和生命活动提供重要信息。
医学诊断 超薄切片技术广泛应用于病理学诊断中，通过对病变组织 进行超薄切片制作，能够观察到细胞和组织的细微变化， 为疾病诊断提供依据。
切片厚度
超薄切片的厚度通常在50-100纳米之 间，这种厚度使得电子束可以穿透切 片，从而观察到样品的内部结构。
技术发展历程
起源
超薄切片技术起源于20世纪40年 代，最初用于生物学领域，后来
逐渐扩展到其他领域。
早期发展
在50年代和60年代，该技术得到 了迅速发展，并逐渐完善。
超薄切片技术
超薄切片技术·为透射电子显微镜观察提供超薄样品的专门技术·生物学中研究细胞、组织超微结构最常用技术·生物学中其他电子显微技术（电镜放射自显影、电镜细胞化学、免疫电镜技术等）的关键性技术。
目前有关生物体的各种细胞、组织的超微结构知识几乎都是这种技术提供。
超薄切片：一般厚度在10～100nm的切片。
这种切片的技术――超薄切片技术制作一般过程（与光学显微镜的石蜡切片过程原则上基本相似）：取材、固定、（浸洗）脱水、渗透、（胶囊）包埋、聚合、（样品修块）、切片、（捞片－切片沾在载网上）、染色等几个环节利用超薄切片技术制备样品的实验过程较长，从样品取材到电镜观察大约需要一周时间。
由于步骤多，时间长，操作时必须十分认真，做好每一步实验。
无论哪个环节出现问题，都不能得到理想的实验结果。
衡量超薄切片的质量：1．样品结构保存良好；2．切片厚度为60nm左右；3．切片均匀，表面无褶皱，无刀痕、无震颤及染色沉淀等现象；4．切片反差适中；5．样品支持膜耐受电子束轰击，观察时无膜的漂移和破裂现象。
I．取材II．固定1．固定的目的及良好固定的标准2．几种常用的固定剂3．几种常用的缓冲液4．几种常用的固定液及配方5．固定方法6．固定时注意事项III．脱水1．脱水的目的及其过程2．脱水过程中的注意事项IV．渗透与包埋1．常用的包埋剂及配方2．渗透与包埋的步骤3．渗透与包埋过程中的注意事项V．超薄切片1．超薄切片的准备工作2．切片VI．切片染色1．染色的作用2．染色的方式I．取材关键环节，取材正确与否与制备出来的样品能否符合观察要求直接有关。
肌体内酶作用下的代谢非常迅速，生物组织离体后，细胞将会立即释放出各种水解酶引起细胞自溶，使细胞内部微细结构发生变化。
这种微细结构的改变在光镜下无法看到，但电镜下呈现明显的人工假象。
尽可能避免人工假象，正确取材的几点要求：1．切取组织块时必须快速，以尽量保持材料的新鲜，一般要求在一分钟内把组织块浸入固定液；组织块要小，一般切成0.5～1.0mm3大小，太大则在短时间内固定液不能渗透到组织块内部；2．所用的固定液及容器都必须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶；3．由于电镜观察视野小，具有很大的局限性，所以，选择部位要准确可靠。
超薄切片
摇匀,室温离心,1500rpm20min 摇匀,室温离心,1500rpm20min 血浆、白细胞层、红细胞层) 3层(血浆、白细胞层、红细胞层)
弃上清，沿管壁加入2 2.5%戊二醛 戊二醛2ml 室稳静置30min 弃上清，沿管壁加入2-2.5%戊二醛2ml 室稳静置30min
用针尖或细棒轻轻挑出透明层(白细胞层), 用针尖或细棒轻轻挑出透明层(白细胞层),切成小块 ),切成小块 2%戊二醛固定 小时,漂洗, 戊二醛固定1 2%戊二醛固定1小时,漂洗,锇酸后固定
(四)固定液的配制
1.常用的缓冲液 (1)磷酸盐缓冲液 最富有生理学功能,但易沉淀, 最富有生理学功能,但易沉淀,易被细菌污染 (2)二甲砷酸钠缓冲液 稳定,可长期保存, 稳定,可长期保存,但因含砷而有毒性
2.锇酸固定液的配制 3.戊二醛固定液的配制 多聚甲醛— 4.多聚甲醛—戊二醛固定液的配制
(五)固定方法 1.浸泡固定法 (1)常规组织块的戊二醛—锇酸双固定法 常规组织块的戊二醛 戊二醛— 1mm3组织块,2-4%冷戊二醛,4℃浸泡固定2小时 组织块,2-4%冷戊二醛 ℃浸泡固定2 冷戊二醛,4
电镜生物样品制备技术
超薄切片技术 厚度500 700Å 不超过1000 5001000Å 厚度500-700Å,不超过1000Å，是电镜生物样品制备方 法中最基本的技术。 法中最基本的技术。 制备过程 取材 固定 漂洗
脱水
渗透、包埋、 渗透、包埋、聚合
切片
染色
一. 取 材
（一）取材前注意事项 （二）取材的要领 1.部位准确 2.快.<3min 3.小.<1mm3 低温操作, 4.低温操作, 0-4oC 5.避免损伤 6.器材保持干净 （三）取材的方法 组织块 组织条 1mm3小块
(完整版)2-1、超薄切片技术原理
光学显微术中常用的长度单位是：“微米”（μ）,电镜是研究超微 观物体的工具,其分辨能力比普通显微镜大1000倍以上。
在电子显微术中,通常用“埃”（A）或毫微米（nm或mm）来表 示。它们之间的换算关系如下：
1毫米（mm）=1000微米（μ） 1微米（μ）=1000毫微米（nm或mu） 1毫微米（nm或mu）=10埃（A） 1毫米=103微米=106毫微米=107埃
一、取材和固定
轻：样品的超微结构脆弱，为防止各种人为的损伤，
在操作过程中要格外小心，最好选用新的锋利的 解剖工具，操作尽量轻巧，以避免挤压。
优：优质的固定是关键环节之一，遇到特殊情况时最
好根据样品本身的要求，经过反复实验选用最佳 的固定条件。
一、取材和固定
2．操作方法：
(1)动物组织块处理方法： 用乙醚使动物轻微麻醉，迅速解剖，准确地取下材料，立即浸入2％
我们把电镜观察的样品制备方法总称为样品制 备技术。
一、超薄切片技术
用超薄切片法，可得到25埃左右的分辨率； 同电镜本身早已达到2-3埃的分辨本领相比，还 有相当大的“差距”。
这种差距意味着许多结构细节尚未被人们发现 和认识，同时也告诫人们不能满足现今已有的制 样技术。
一、超薄切片技术
在电镜技术中，有两种分辨率： 一种是电镜本身的分辨率， 二是样品制备上的分辨率，
同一台电镜，谁的样品制备得好，它就能使细 节观察得更确切，更清晰，拍出更真实的照片。
对于研究生物医学的工作者来说，研究和熟练 地掌握制样技巧是极为重要的一环。
一、超薄切片技术
石腊切片机的最高水平可以把片子切到1-2微米。 现代的超薄切片机从改进石腊切片机出发寻求途 径。目前的超薄切片机可以以连续切片的方式把一 个细胞切成几十片或几百片来进行电镜观察。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
二、样品支持膜 为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。
1.对膜的要求： ❖本身没有结构，薄而透明，电子束易通过； ❖有足够的机械强度，经得住电子束的轰击； ❖不与样品发生化学反应。 ❖厚度在10～15nm
2.常用支持膜及其制备 福尔莫瓦膜（Formvar):
化学名称：聚乙烯醇缩甲醛. 特点：机械强度高，制作简便. 制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。
固定
理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。
↓
脱水
↓
包埋
二钾胂酸盐 有毒，稳定性好。适用于细胞化学和
↓
缓冲液
保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究
切片
↓
可长期保存
染色
↓ 镜检(4)固定时间、温度及来自品块大小取材↓
固定 时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料
↓
及厚壁组织较长。1～12小时。
脱水
↓
↓
蒸馏水洗净后再取材固定。
切片 ➢悬浮样品的获取：
↓
加入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。
染色 ➢ 野外取材： 保低温
↓
携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定；
镜检
植物材料可保湿带回实验室再取材固定。
二、固定
取材
用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程
↓
1.固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活
第四章 透射电镜生物样品 制备技术
第一节 载网和支持膜 第二节 超薄切片的制作 第三节 负染色技术
第一节 载网和支持膜
一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。 1.载网的类型及选择： 70％的透过率
铜网：常规超薄切片(200目以上)
金属网 载网
惰性网：细胞化学
非金属网： X射线元素分析
2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。
取材
固定
漂洗
50%
70%
80%
聚合
37~60℃
23
包埋
2
浸透
过渡
100%
95%
室温
90%
修块
切片
捞片
观察
染色
一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中 获取所需要的研究材料的操作过程。
取材 ↓ 1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。
固定 •准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。 ↓
脱水 •快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。 ↓
包埋 •体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm³
↓ 切片
或1×3mm长条。
↓ 染色
•低温：固定液及器材需预冷(0~4 ℃)，以降低自溶酶的活性。
↓ 镜检
•防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。
2.取材方法： 注意部位和方向性。
温度： 低温以抑制酶的活性，通常在0~4℃条件固定。
包埋
↓ 切片
样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到 良好固定。
↓
染色
↓ 镜检
7. 注意事项
取材
↓
（1）控制固定温度0~4℃利于抑制酶的活性，减少细胞
镜检
待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。
用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）
6.影响固定效果的因素
取材 (1)固定液的酸碱度：
↓
固定 固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。
↓
脱水 例如多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.2~7.4；
↓
植物体的pH值为6.8~7.1，所以常用PH7.0~7.2；
固定 (2)双固定法： 戊二醛—锇酸双重固定
↓
脱水 (3)原位固定法：
↓
用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，
包埋
在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，
↓
待组织适度硬化后再取材作常规固定。
切片
常用醛类固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等
↓
染色 (4)灌流固定：
戊二醛
↓
通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，
火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。
碳膜：稳定性好，高分辨制样。
操作方法
1.福尔莫瓦支持膜的制作方法
膜
0.2~0.5%的 氯仿溶液
蒸馏 水
2.火棉胶膜用平皿水面展开法：
平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液， 待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。
3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。
固定
状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。
↓
脱水 2.固定的类型：
↓
物理固定法： 超低温快速冷冻固定法
包埋
固定 化学固定法：使用化学试剂快速杀死细胞
↓
3.固定液的作用：
切片
•迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；
↓
•破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；
染色
•通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；
↓
第二节 超薄切片的制作
超薄切片：是指厚度小于100 (50~70)纳米的切片。
要求：厚薄均匀、厚度符合标准； 无皱褶刀痕、震颤和沉淀； 细胞结构保存良好，具有良好的电子反差； 具有一定程度的机械强度。
制作流程：包括六大步，40多次操作
取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→ 镜检
超薄切片制作流程图
0~4℃
↓
包埋
配成2.0～5.0％。 选用：单细胞 微生物 动物组织 植物组织 厚壁组织
↓
切片
1~2.0
浓度
%
高
5.0%
↓
染色 锇酸(OsO4) 是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染
色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保
↓
存核酸和糖类。
镜检
5.固定方法：
取材 ↓
(1)单固定法： 用于易于渗透的材料和酶的细胞化学
•提供一定的电子反差。
镜检
4.常用固定剂及其特点
取材
↓ 醛类： 甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛
固定 戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核
↓
酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保 存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。
脱水 配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.8~7.2)
取材 ➢ 动物材料的获取：
↓
急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成
固定
标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难
↓
取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。
脱水 ➢ 植物材料的获取： 需抽气使样品沉底
↓
叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的
包埋 材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡，
包埋
原生动物及胚胎适于pH为8.0~8.5，胃黏膜pH为8.5
↓
效果最佳；
切片 (2)固定液的渗透压： 直接影响被固定细胞的原有特定形态
↓
染色 固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡。
↓
镜检
电解质：钾钠钙(0.5% CaCl)可防止膨胀 非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂
（3）缓冲液类型
取材
↓ 磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生