Hep-2型细胞灵长类肝组织复合片检测抗核抗体的应用
抗核抗体测定及其临床意义
抗核抗体测定及其临床意义【中图分类号】r512.62 【文献标识码】a 【文章编号】1672-3783(2012)09-0099-01抗核抗体又名抗核因子是泛指一类具有抗各种核成分的抗体。
它是一种自身抗体,是自身免疫病实验室检查的重要项目之一。
自1948年发现红斑性狼疮(le)细胞以来,对抗核抗体进行了广泛、深入的研究,但由于核抗原的多样性和复杂性,因此有关它的免疫特性、检查方法以及临床意义等问题还没有完全解决。
抗核抗体的免疫特性抗核抗体是机体在自稳机理失调情况下产生的一种抗自身核抗原的抗体,主要存在于igg,也见于igm、iga甚至igd和ige中。
1 抗核抗体的测定原理将稀释后的待检血清或脑脊液、胸水、腹水等体液标本滴加在含有hep-2细胞和灵长类肝脏的载片反应区上反应，如果被检血清中存在抗细胞抗原成分的抗体，则可以特异性的与抗原基质片hep-2细胞和灵长类肝脏中的抗原成分结合形成抗原抗体复合物，再与兔或羊抗人免疫球蛋白igg荧光素标记抗体反应，然后在荧光显微镜下观察特异性荧光模型。
2 镜下抗核抗体的核型2.1 均质型：细胞核均匀着染荧光，有些核仁部位不着色，分裂期细胞染色体可被染色出现荧光。
与均质型相关的自身抗体主要有抗不溶性dnp，抗组蛋白抗体，抗dsdna抗体也可产生均质性。
高滴度均质型主要见于sle患者，低滴度均质型可见于ra、慢性肝脏疾病、传染性单核细胞增多症或药物诱发的狼疮患者。
2.2 颗粒型（斑点型）：细胞核内出现颗粒状荧光，分裂期细胞染色体无荧光显色。
与斑点型相关的自身抗体涉及抗核糖体核蛋白颗粒抗体，如抗sm、抗ru1rnp、抗ssb／la等抗体。
高滴度的斑点型常见于mctd，同时也见于sle、硬皮病、ss等自身免疫性疾病。
2.3 核周（核膜）型：又称周边型（rim），荧光着色主要显示在细胞核的周边形成荧光环，或在均一的荧光背景上核周边荧光增强；分裂期细胞染色体区出现荧光着色。
抗核抗体的检测方法及原理
抗核抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法、放射免疫法、ELISA测定法和免疫印迹测定法。
以下是这些方法的简要介绍和原理：
1.间接免疫荧光法：此方法是检测抗核抗体的常用方法之一。
原理是将待测标本与细胞底物片（如HEp-2细胞）的相应抗原进行反应，然后加入
荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体（通常为抗IgG抗体），形成抗原-抗体-荧光二抗的复合物。
通过荧光显微镜观察，可以判断待测标本中是否存在针对细胞相关抗原的自身抗体。
2.放射免疫法：此方法常用于检测抗DNA抗体。
原理是用同位素标记DNA，与被检血清中的抗DNA抗体结合，然后通过沉淀和对比沉淀物与上
清液中的放射活性，得到DNA的结合活性。
结合率高于一定值（通常为20%）则判断为阳性。
3.ELISA测定法：即酶联免疫吸附法，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在
固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗去，最后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。
4.免疫印迹测定法：此方法是将混合的抗原作为凝胶电泳分离，然后转印到硝酸纤维素的薄膜上，再用标记抗体进行检测和分析。
以上各种方法都有其特点和适用范围，可以根据实验需求和条件选择合适的方法进行检测。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第二十四章 自身免疫性疾病及其免疫检测(附答案解析 )
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第二十四章自身免疫性疾病及其免疫检测（附答案解析）一、A1型题1、可检出RF免疫球蛋白类别的方法是（）。
A、胶乳凝集B、速率散射比浊法C、ELISA法D、电泳法E、TRUST2、RF免疫球蛋白的主要类别是（）。
A、IgGB、IgAC、IgMD、IgEE、IgD3、关于RF描述错误的是（）。
A、以变性IgG为靶抗原的自身抗体B、抗人或动物IgGFab片段的抗体C、与人或动物变性IgG结合D、不与正常IgG发生凝集E、多见于类风湿关节炎患者4、自身抗体的特征不包括（）。
A、是自身免疫性疾病的主要标志B、高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点C、自身抗体是临床确诊的重要依据D、自身抗体是指导临床用药的重要依据E、自身免疫性疾病可不伴有特征性自身抗体谱5、下列哪一种自身免疫病患者最可能检出抗自身IgG抗体（）。
A、恶性贫血B、重症肌无力C、自身免疫性溶血D、类风湿性关节炎E、肺肾出血性综合征6、下列哪种疾病是非器官特异性自身免疫疾病（）。
A、重症肌无力B、慢性甲状腺炎C、慢性溃疡性结肠炎D、系统性红斑狼疮E、特发性血小板减少性紫癜7、不属于自身免疫性溶血性贫血特点的是（）。
A、体内出现抗红细胞自身抗体B、抗人球蛋白试验阳性C、红细胞寿命缩短D、多见于青年男性E、多继发于淋巴系统恶性病、结缔组织病、感染和药物应用后8、以下叙述正确的是（）。
A、ANA无器官特异性，有种属特异性B、ANA无器官特异性，无种属特异性C、ANA有器官特异性，无种属特异性D、ANA无器官特异性，有种属特异性E、ANA既有器官特异性，又有种属特异性9、下列说法错误的是（）。
A、抗核抗体（ANA）是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称B、ANA的性质主要是IgG，也有IgM、IgA和IgDC、ANA主要存在于血清中，也可存在于胸腔积液、关节滑膜液和尿液中D、ANA阳性一定患有自身免疫性疾病E、正常老年人也可有低效价的ANA10、下列哪种疾病是非器官特异性自身免疫疾病（）。
抗核抗体检测在乙肝患者中的应用价值
抗核抗体检测在乙肝患者中的应用价值作者：郑红霞郭飞飞来源：《中国实用医药》2013年第33期【摘要】目的分析乙肝患者血清中抗核抗体（ANA）的阳性率，探讨其临床应用价值。
方法采用间接免疫荧光法（IIF）对90例乙肝患者和90例健康体检者血清中的ANA进行检测，并测定其ALT、AST。
结果 90例乙肝患者中ANA的阳性率为18.9%，荧光模型以核颗粒型为主；ANA阳性组的ALT、AST高于ANA阴性组，差异有统计学意义。
结论 HBV可诱导机体产生低滴度的抗核抗体，自身抗体的产生与肝脏的损伤程度存在一定的相关性。
【关键词】抗核抗体；乙型病毒性肝炎乙肝病毒（HBV）是导致乙型病毒性肝炎的病原体。
近些年的研究表明乙肝患者的肝细胞损伤并不是由HBV直接作用引起的，而是通过诱导机体产生针对HBV的免疫应答引起肝细胞免疫损伤，表现为CD8+CTL对受感染肝细胞的细胞毒效应[1]。
在乙型肝炎的发生和发展过程中可能涉及针对自身抗原的免疫应答。
抗核抗体（antinuclear antibody， ANA）是一组将自身真核细胞的各种成分例如核糖核蛋白、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应[2， 3]。
随着研究的不断深入，科学家们开始在乙肝患者的血液中发现多种非特异性自身抗体[4]。
为进一步了解自身免疫性抗体在乙肝发生和发展中的临床意义，本研究采用间接免疫荧光（IIF）和免疫印迹法（western blot）检测90例乙肝患者和90例正常人血清中的ANA，探索自身抗体在乙肝发生和发展中的作用。
1 资料与方法1. 1 一般资料本研究选取2012年6月～2013年5月在本院感染科和消化科住院的乙肝患者90例作为实验组，其中男性48例，年龄30～65岁；女性42例，年龄32～63岁。
所有乙肝病例的诊断均符合2000年中华医学会制定的诊断标准。
对照组为来本院体检健康体检者，其中男性45例，年龄29～62岁；女性45例，年龄30～58岁。
细胞分子免疫学-间接免疫荧光法检测抗核抗体精品文档
间接免疫荧光法检测抗核抗体
<<细胞与分子免疫学技术>>
实验原理
ANA (Antinuclear Antibodies) 是针对细胞核成分的 自身抗体 间接免疫荧光法检测ANA是初步筛选实验 ANA阳性提示患有自身免疫性疾病SLE和其他不同类 型的风湿病，抗体滴度≧1:100 Hep-2细胞为抗原基质，产生的荧光核型与靶抗原的 分布部位有关
FITC-羊抗人 IgG: 20 µl per field 孵育 30min
PBS/Tween20
Wash PBS-TwΒιβλιοθήκη en冲洗1 s5 min 浸泡
抗原片背面滤纸吸干
清水冲 洗加样 板，滤 纸擦干
Glycerol/PBS
生物薄片上滴加1滴磷酸 盐缓冲甘油
北京欧蒙生物技术有限公司 抗核抗体谱（IgG）检测试剂盒
抗原片组合：Hep-2细胞+灵长类肝脏冰冻切片 ANA没有器官和种系的特异
(Homogeneous nucleoplasmic)
(在SLE中阳性率40%-70%)
(Coarse speckled nucleoplasmic)
(Fine speckled nucleoplasmic)
Hep-2
10X100X1000X 4L 标本 + 36 LPBS-Tween
25 µl per field
加样板
PBS 原液、1:10、1:100、1:1000
孵育 30min
PBS-Tween冲洗1 s
5 min 浸泡
抗原片背面滤纸吸干
清水冲 洗加样 板，滤 纸擦干
PBS/Tween20
加样板
核仁型（Nucleolar pattern）
抗核抗体(ANA)检测与临床应用
临床发病特点
发病率: 40/100,000(北欧);200/100,000(黑人);250,000 (美国)
患者寿命:4年/50%(1950); 15/80%(当前); 20岁诊断/35岁死亡几率1:6
SLE—各器官的表现
神经系统受累（30%） 皮肤（蝴蝶状皮疹, 盘状狼疮; 74%）)
浆膜炎（胸膜炎, 心包炎； 77%）) 狼疮肾炎 (51%）
HEp-2细胞/猴肝
HEp-2细胞
猴肝
SS-A抗原
RNA + SS-A (60 kDa) + Ro-52
RNA + SS-A (60 kDa)
hY-RNA
hY-RNA
Boire et al., 1995: - Ro-52抗体不与SS-A 抗原结合 - 纯化的 SS-A 抗原不包含 Ro-52
SS-A(Ro-60), Ro-52, SS-B
ANA检测的临床意义
• ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊 断、病情判断和疗效观察的指标 • 高滴度ANA则高度提示自身免疫性疾病 • 在非结缔组织病中也可出现阳性；正常人中（特别是老年人）也可出 现阳性，但滴度低
目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。
抗Ro-52抗体
风湿性疾病中的阳性率
疾病 干燥综合症 系统性硬化症 肌炎 SLE MCTD RA n 88 81 26 210 21 165 抗Ro-52抗体阳性 81 % 28 % 31 % 38 % 19 % 5%
抗Ro-52抗体 在干燥综合症中阳性率较高，但没有疾病特异性
Meyer, Schlumberger et al., 4th Asian Congress on Autoimmunity, Singapore, Sept. 2009
抗核抗体基本概念及对应临床疾病概述
抗体滴度
临床意义
1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560
阳性，需结合临床表现综合判断 阳性，提示可能存在相关疾病 明确阳性，提示可能存在相关疾病 中等阳性，提示可能存在相关疾病 强阳性，高度提示存在相关疾病 极强的阳性，高度提示存在相关疾病。
h
14
HEOBp公-2司细间胞接产免品疫系荧列光法（产举品例系）列
40 S 亚基
P1 P1
P0
60 S
亚基
P2 P2
▪相关疾病: SLE:
为SLE的高特异性指标，阳性率为5-15%，常见于神经狼疮。
h
31
AMA与AMA-M2
▪ 靶抗原: 线粒体亚结构上几种生化性质明确的物质，可分为九 种类型。其中最常见临床意义比较明确的为AMA M2，由AMA不同 亚型的临床相关疾病，因而对AMA阳性结果做进一步的分型实验 非常重要。
h
16
条带酶免分析法检测ANA—基本原理
底物
颜色反应 碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体
IgG抗体 硝酸纤维膜
LIA检测方法原理
h
17
ANA谱系列
h
18
U1-nRNP 和 Sm抗原
SLE: 15-40% MCTD: 95-100%
功能:参与mRNA前体的剪切 h
SLE: 5-30%
19
SS-A (Ro-60), Ro-52 和SS-B
h
6
间接免疫荧光法检测ANA—基本原理
FITC标记的抗人IgG抗体
间接免疫荧光法 h
样本中ANA-IgG 包被HEp-2细胞的基质玻片
7
ANA筛查的经典和标准基质: HEp-2
抗核抗体检测的临床应用
三、ANA检测方法
ANA特异性自身抗体可采用多种免疫学方法检测，不同的检测方法具有 不同的临床应用优缺点。
ELISA具有高敏感性、定量及易自动化的优点，但需对每个自身抗体进 行逐项检测。
线性免疫印迹法(line immunoassay, LIA)具有高敏感性、易操作、易自动 化及一次实验操作可同时检测多种自身抗体的优点，但其检测结果为半 定量，某些自身抗体的特异性偏低。
二、ANA检测的临床应用范围
ANA作为AID重要的生物学标志，常见于SLE、干燥综合征(Sjögren′s syndrome，SS)、系统性硬化症(systemic sclerosis，SSc)、混合性结缔组织 病(mixed connective tissue disease，MCTD)及多发性肌炎(polymyositis， PM)/皮肌炎(dermatomyositis，DM)等系统性(非器官特异性)AID患者。
IIF-ANA检测结果判读及报告人员应有培训、考核及定期进行结果判读比 对。
采用ELISA等其他检测方法的ANA检测结果应包括检测结果的定量数值 和单位、参考区间及必要的临床建议。
ANA针对靶抗原的特异性自身抗体检测结果报告应包括检测方法、定性 结果(若为定量检测方法应包含定量数值和单位)及参考区间，同时应包括 必要的临床建议。
自身抗体检测实验室的ANA结果报告形式基于ANA的最新定义，将HEp2细胞胞浆荧光模型及细胞有丝分裂期荧光模型纳入ANA阳性结果。其报 告格式范例见表1。
五、ANA检测结果报告
六、临床意义及解读
IIF-ANA检测结果报告应包括：检测方法、定性结果(阳性/阴性)、荧光模 型、滴度及必要的临床建议。对于混合荧光模型，荧光模型的报告优先 级顺序为细胞核荧光模型、细胞浆荧光模型、细胞有丝分裂期荧光模型。 相同优先级的荧光模型，建议按滴度高低顺序依次报告。
欧蒙抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程
抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程1.目的规范抗核抗体谱(IgG)检测，保证结果的准确性。
2.适用范围检验科免疫组工作人员。
3.试剂规格名称与组成型号名称：ANA 谱 1靶抗原：nRNP/Sm，Sm，SS-A，Ro-52，SS-B，Scl-70，Jo-1，CENP B，dsDNA，核小体，组蛋白，核糖体 P 蛋白类型：IgG基质：抗原包被的检测膜条规格：16×01(16)4.预期用途：用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P 蛋白和 AMA M2 共 14 种不同抗原 IgG 类抗体。
5.适应症：夏普综合征（MCTD），系统性红斑狼疮（SLE），干燥综合征，进行性系统性硬化症，多肌炎皮肌炎、重叠综合征、局限型进行性系统性硬化症（CREST 综合征），原发性胆汁性肝硬化。
6.临床意义：抗核抗体识别是各种细胞核组分（细胞核的生化成份）[1,2]，包含核酸、细胞核蛋白及核糖蛋白。
可特征性地出现于许多疾病中，尤其是风湿性疾病[3,4,5]。
在炎症性风湿性疾病中，这些抗核抗体的阳性率在 20%到 100%之间，以风湿性关节炎的阳性率最低，在 20%至40%之间。
因此，ANA 鉴别诊断在对个别风湿疾病的确认十分必要，而且对自身免疫性疾病的进一步诊断也很有价值。
[3,6,7,8,9,10,11]风湿疾病—夏普综合征（混合结缔组织病＝MCTD)[8]—系统性红斑狼疮（SLE)[8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]—干燥综合征（原发性干燥综合征）[5],—系统性硬化症（系统性硬皮病,SSc)[1, 23],—局限型系统性硬化症（CREST 综合征） [28]—多肌炎/皮肌炎[12,15]—类风湿性关节炎[5]7.主要组成成分：8.储存条件及有效期： 2-8°C 保存，不要冷冻。
自身抗体的检测
荧光模式： 大鼠食管，仅限于上皮角质层的较强的线性分层的均质荧光。
STEP1
STEP2
自身抗原：丝聚蛋白（filaggrin）为AKA的靶抗原。
临床意义：见于RA，阳性率36~59%，特异性95~99%。还是一个潜在的预后标志，高抗体滴度可能预示着较严重的RA类型。
抗角蛋白抗体（AKA）
抗肝肾微粒体抗体（LKM）
01
临床意义：高滴度的抗RNP抗体为 混合结缔组织病（MCTD）的特征，发生率为95~100%。也可出现于SLE，但总是与抗Sm抗体同时出现。抗Sm抗体对SLE具有高度特异性，发生率为20~40%。
02
抗RNP/Sm抗体
抗SSA／SSB抗体
荧光模式 Hep-2片：细胞核呈细颗粒荧光，核仁不发光。 肝组织片：细颗粒荧光。
自身抗原：为丝氨酸蛋白酶-蛋白酶3（PR3）。该靶抗原为可溶性蛋白，存在于正常中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中。
01
临床意义：cANCA可见于多种系统性血管炎。主要见于Wengener’s肉芽肿，约占ANCA阳性率的80~95%。cANCA被认为是活动性Wengener’s肉芽肿和微多动脉炎的特异和敏感的标志性抗体。还见于Churg-Strauss综合征。
02
抗中性粒细胞胞浆抗体（胞浆型）
抗中性粒细胞胞浆抗体（核周型）pANCA 荧光模式： 乙醇固定的中性粒细胞：细胞核周围平滑的带状荧光，细胞核阴性。 猴肝：肝血窦区粒细胞强荧光，而肝细胞阴性。
自身抗原：主要抗原为髓过氧化物酶（MPO），其他抗原还有白细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G、溶菌酶及乳铁蛋白等。
分裂期细胞阳性
荧光模式：
抗着丝点抗体(ACA)
Hep-2：细胞核细的、相同大小的颗粒荧光，分裂期颗粒荧光带状位于细胞中间。 肝组织片：分布于细胞核的10~20个颗粒，荧光弱，易被忽略。
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Hep-2型细胞/灵长类肝组织复合片检测抗核抗体的应用
目的探讨用间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）时复合抗原片的应用价值。
方法分别用3种抗原片（Hep-2型细胞/灵长类肝组织复合片，Hep-2型细胞片，鼠肝匀浆片）检测抗核抗体，比较检出率和特异性。
结果复合抗原片的检出率高、特异性好。
结论运用Hep-2型细胞/灵长类肝组织复合抗原片检测ANA，有利于对自身免疫性疾病的初步筛选和判断。
关键词复合片抗核抗体
在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）、皮肌炎、硬皮病患者的血清中常存在自身抗体间接免疫荧光法（IIF）是检测细胞内抗原自身抗体的“金标准”。
其检测用的抗原片一般为组织培养细胞、器官冰冻切片、鼠肝匀浆片等，现将用Hep-2型细胞/灵长类肝组织复合抗原片检测抗核抗体（ANA）的临床应用情况报告如下。
1 材料与方法
1.1 血清标本患者组:来自我院2003年1月～2004年10月住院和门诊患者，共计65例。
其中SLE38例，皮肌炎9例，硬皮病9例，SS7例，混合组织结缔病2例，所有患者均符合美国风湿病学会制定的诊断标准。
正常对照组30例，均为健康体检者。
1.2 试剂和仪器Olympus BH-2型荧光多功能显微镜，ANA复合抗原片和抗可溶性抽提抗原抗体（ENA）的检测试剂为德国欧蒙公司提供，抗双链DNA检测试剂为福建兰波生物工程公司提供。
1.3 应用免疫斑点法检测ENA（标本1∶100稀释）检测针对平滑肌抗原（SM），U1核糖核蛋白抗原（RNP），干燥综合征（SSA，SSB）的RO、LA抗原，硬皮病70000抗原（SCL-70）和多发性肌炎抗原（JO-1）的抗体。
按操作说明书进行，免疫金斑点渗滤法检测抗双链DNA，按操作说明书进行。
1.4 IIF法检测ANA（标本1∶100稀释）方法:（1）用Hep-2型细胞/灵长类肝组织复合片作为抗原片，（2）用HEP-2型细胞作为抗原片（万孚公司提供），（3）用鼠肝匀浆片作为抗原片（自制）。
采取间接免疫荧光法检测。
以出现特异性荧光为ANA结果阳性，反之为ANA结果阴性阳性结果标本同时进行ENA、抗双链DNA的检测，进行特异性自身抗体检测。
2 结果
95例血清标本ANA检出情况见表1。
表1 95例血清标本ANA检出情况（略）
3 讨论
3.1 间接免疫荧光法（IIF）此法是检测细胞内抗原自身抗体的“金标准”，检测用的抗原片一般为组织培养细胞、器官冰冻切片、鼠肝匀浆片等，现在大部分已被Hep-2型细胞代替，然而还有非常少的一部分ANA，有时不能用Hep-2型细胞检测到，但却能用肝组织和其他器官的组织切片检测到［1］，因此，对ANA的正确检测必须使用Hep-2细胞/灵长类肝组织复合片联合测定，从表1中可知，联合检测提高了ANA 的阳性检测率。
3.2 联合片的运用有利于对阴性结果的判断在实际检测中，阴性结果Hep-2型细胞有时会出现绿色微弱荧光，此时，肝组织片不发荧光，只会出现非特异性的杂光。
有报道，Hep-2型细胞法检测ANA敏感性
高，但特异性低于肝组织切片法［2］。
在阳性结果的最终滴度检测中肝组织片要先于Hep-2型细胞不出现荧光。
因此，联合片的运用更加有利于最终滴度及阴性结果判断。
3.3 联合片的运用有利于将某些自身抗体预先区分［1］在实际检测中抗SM、抗U1-NRNP、抗双链DNA等的荧光模式，在Hep-2型细胞和肝组织上有相同的荧光强度而抗SS-A、抗SS-B等的荧光模式，在Hep-2型细胞上的荧光强度强于肝组织的强度，虽然最终的区分需要进一步检测，但两种不同基质的联合使用显示出的荧光模式对下一步的检测提供了有利选择。