抑菌试验操作规程
抑菌试验
5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津 杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。
6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的药 液或待检样品。
7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。
8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参 考表的标准判读结果，按敏感（S）、中介 （I）、耐药（R）报
一、实验原理
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。 在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌
物质的浓度即为该菌悬液中对该种指示菌的 最低抑菌浓度（MIC） 。 抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度 呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
二、实验材料
培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 菌种：
注意事项
在超净工作台中或酒精灯旁操作 平板倒好，一定要平 牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀
的向四周扩散 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适
中，防止出现抑制圈重叠，可在平皿中央 摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
药敏试验
抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是 指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验， 测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制 作用，以指导选择治疗药物和了解区域内 常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治 疗选药
大肠杆菌（E.coli) 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 药品：阿莫西林、黄芪多糖、 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、 移液枪、 1mL、200uL 枪头、 恒温培养箱、 超净工 作台、接种环
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
抑菌实验方案
抑菌实验方案抑菌实验方案一、菌种大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538二、培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15~20g，用10mol/LNaOH调pH，范围7.0~7.4倒平板（平板培养基）1.将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。
高压灭菌或干燥灭菌后备用。
2.取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，先左手持三角瓶,右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞或硅胶赛(或不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞) ,同时将三角瓶转换至右手，而后左手拿平皿,以大拇指和中指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。
三角瓶口经火焰烧灼后，倾入灭菌或溶化、冷却至55~60°C的培养基约15mL(勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁)，迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿底部,冷凝后即为平板培养基。
有时凝固后的培养基表面有冷凝水，可将平皿盖打开倒置于37℃温箱，除去冷凝水，否则将影响平板分离培养效果。
为防止冷凝水过多，也可将培养基冷却至45 ~ 50°C再倒平板。
培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。
一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用三、器械培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤（一）、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌反复转种2次，使菌种新鲜，置30℃恒温培养箱培养1d，备用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃混匀。
3、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板4、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
杀菌和抑菌试验操作规范
杀菌和抑菌试验操作规范一、总则适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。
引用标准：消毒技术规范2002二、术语消毒 disinfection杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。
灭菌 sterilization杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。
消毒剂 disinfectant用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。
灭菌剂 sterilant可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。
杀灭时间 killing time, KT用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后, 培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间 (min)杀灭率 killing rate, KR在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。
灭对数值 killing log value微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较, 以其减少的对数值来表达杀灭效果。
三、菌悬液与菌片的制备(一) 试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。
(二) 试验器械A. 无菌蒸馏水B. 细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等C. 刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。
D. 数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。
E. 浊度计F. 游标卡尺(三) 细菌繁殖体悬液的制备1 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃培养 18h～24h。
挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃培养 18h～24h，即为第3 代培养物。
抑菌实验研究
实验方法（抑菌实验研究）配制细菌培养基100ml（牛肉膏蛋白胨培养基）成分：牛肉膏0.5g 蛋白胨1g 氯化钠0.5g 琼脂2g蒸馏水100ml 1mol/LNaOH 1mol/LHCl器材：三角烧瓶小烧杯量筒玻璃棒天平药匙高压蒸汽灭菌锅PH试纸棉花牛皮纸记号笔麻绳纱布刀片超净工作台操作步骤：1.按照培养基配方比例准确称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。
用玻璃棒挑取牛肉膏到称量纸上，称量后直接放入水中。
加热后牛肉膏便与称量纸分离。
蛋白胨容易吸潮，称取时动作要快。
2.在上述烧杯中加入比需要量少的的水，用玻璃棒搅拌均匀，然后再石棉网上加热使其溶解，完全溶解后将称好的琼脂加入已经融化的药品中，边加热边搅拌，最后量筒定容用蒸馏水补足总体积。
3.用精密PH试纸测PH，如果偏酸，则逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达到7.6。
反之则用1mol/L的HCL调节。
加塞在三角瓶口加上棉塞包扎在加塞后的三角瓶口外包一层牛皮纸，其外用麻绳绑好灭菌将上述三角瓶高压灭菌配制菌悬液将培养在试管斜面的菌种，划在平皿上，37摄氏度培养16小时，然后去适量无菌水冲洗平皿上的菌落，即可制成菌悬疑。
操作步骤事先将平皿若干用高压蒸汽灭菌锅灭菌，然后在超净工作台中无菌操作，倒平皿，冷却即成。
将平皿编号。
将倒好的平皿烘干。
1.向每个平皿中倒入约200l细菌悬液，用涂布棒涂匀。
2.待干燥后，用灭菌后的刀片将平皿分成大小相等的六部分。
3.将高压灭菌过的滤纸小片浸在待测药品中，后用灭菌的小镊子家夹起滤纸小片放在分好的平皿中，盖好盖，37℃培养箱中培养24h。
4.每隔6至8小时观察有无抑菌圈及其大小。
抑菌圈法实验流程
抑菌圈法实验流程
实验目的：通过抑菌圈法检测不同抗生素对细菌的敏感性，为临床治疗提供参考依据。
实验原理：利用纸片或圆筒在琼脂平板上制造抑菌圈，测定不同药物对细菌的抑制能力。
当细菌被抗生素抑制生长时，抑菌圈周围的菌落会出现明显的清晰区域，即抑菌圈。
抑菌圈大小与细菌对该药物的敏感性成正比。
实验步骤：
1. 培养细菌：选取待测菌种，在无菌条件下接种于琼脂平板上，进行预培养。
2. 制备药物纸片：将不同抗生素药物浸泡在无菌纸片中，使纸片充分吸收药物。
3. 在琼脂平板上制造抑菌圈：用无菌铁环或无菌棉签将药物纸片放置于琼脂平板表面，轻轻压实，使药物充分扩散。
然后在纸片周围接种待测菌种，使其均匀生长。
4. 培养细菌：将琼脂平板倒置，放入培养箱中，在适宜的温度下培养细菌。
5. 观察抑菌圈：经过一定时间的培养，观察琼脂平板上细菌的生长状态，记录不同药物纸片周围的抑菌圈大小和形态。
6. 结果分析：根据抑菌圈的大小和形态，判断该菌株对不同药物的敏感性，为临床治疗提供参考。
实验注意事项：
1. 所有操作均在无菌条件下进行，避免外界微生物的污染。
2. 选择合适的药物浓度，避免药物过浓或过稀而影响实验结果。
3. 操作时要注意卫生，避免药物接触到皮肤或口腔。
4. 实验后应及时处理琼脂平板和药物纸片，避免造成环境污染。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌实验程序
抑菌实验程序2 抑菌实验基本程序，先确定抑菌性，后确定最小抑菌浓度(活性)2(1 抑菌性实验:在灭菌平皿中加入牛肉汤培养基后，中间划一线，两侧点接药物和细菌，35?孵育16~20h，看菌与药物接触处菌落是否变形，若变形即为有抑菌性，可进行下面的实验 2(2 最小抑菌活性确定:思路:菌种准备—抗菌培养基(不同梯度剂量)—温育—观察生长情况—确定最小浓度方法:2(2(1 菌种准备:准备10支试管，排成1排，内置去离子水配成的生理盐水(0.8%), 除第1管加入10 ml外，其余每管加入肉汤9ml，在第1管加入活化的菌1-2环，混匀振荡后，吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取1ml弃去，(使用时可通过预实验数菌落数，也可以直接选用其中的第7，8管)即为浓度为104 CFU,一般可直接用于接种测试。
2(2(2 培养基制备:牛肉浸膏琼脂培养基，以1NNaOH或HCl调pH7.2~7.4,灭菌后备用2(2(3 梯度药物浓度培养基制备:准备十支灭菌水的试管，排成一排，除第1管加入1.6ml无菌水外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取1ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
2(2(4 含药平板上接种:将1中的菌点接在准备好的药物琼脂培养基3中，每点直径可以用灭菌的打孔器打孔，直径5-8mm,接好后置35?孵育16~20h，观察2(2(5 结果评定:将平板置于白色底衬下，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抑菌试验操作规程
1．范围
本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。
2．试验前准备
设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。
3．操作步骤
3.1 病原菌的制备
3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。
3.2 检测样品的制备
3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。
3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。
3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。
3.3 双层平板的制备
3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，
放置牛津杯时动作要轻；
3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。
3.4 加样
在牛津杯的孔中加入200μl菌悬液（或无细胞发酵上清液），同时以相应的培养基作为阴性对照。
加样前要在双层平板上做好标记，以免错加或漏加。
加样后的平板，不能随意移动，要保持水平轻拿轻放。
3.5 培养及结果观察
加样结束后，将平板置于恒温培养箱中，37℃培养12~14h，即可观察结果。
用游标卡尺测定抑菌圈直径，当抑菌圈直径大于10mm，即认为检测样品对指示菌有抑菌作用。
童京京
2015-1-15。