炭疽杆菌的快速鉴定
炭疽实验室检测技术
PCR检测引物的设计
炭疽芽孢杆菌的PCR 检测中引物的设计非常关键。 炭疽芽孢杆菌有两个毒力相关质粒pX01 和pX02。
pX01 分子量为110 MDa (185kb) ，携带cya 、 lef 和pag 基因，分别编码水肿因子( EF) 、致死 因子(L F) 和保护性抗原( PA) ； pX02 分子量为60 MDa(95kb)，携带capABC 和dep 基因，分别编码荚膜与参与其生物合成的 酶。
PCR检测引物序列
pagA F: 5' ATT TGC GGT AAC ACT TCA CT 3' pagA R: 5' AGA CCG TGA CAA TGA TGG AA 3' cap外F：5' CCT GGT TGT TCT TTT CGT TGC 3' cap外R：5' CGG ATT GTA TAT GGA GTG GG 3' cap内F：5' TTT CAC CAG CAC CCA CAT AG 3' cap内R：5' GGG ACA GGA ATG TTT GGA TC 3' rpoB 2F：5' CCA ACA GTA GAA ATG CC 3' rpoB 2R：5' AAT TTC ACC AGT TTC TGG ATC T 3'
一些进化研究学者推论,这几种细菌来源于同一个 祖先,为了适应不同的环境而产生分化,炭疽芽孢 杆菌成为温血动物的病原菌,蕈状芽孢杆菌是环境 中的正常菌,对人和动物没有致病能力;而蜡样芽 孢杆菌和苏云金芽孢杆菌处于以上两种菌之间,蜡 样芽孢杆菌是环境中的常见菌,偶尔也会使温血动 物感染;苏云金芽孢杆菌则成为昆虫的致病菌。
炭疽杆菌快速鉴定
炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10 生物技术3 班0326摘要杆菌( Bacillus anthraci )属于需氧杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。
炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。
平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。
皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。
我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性, 再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC03平板CO2培养物的荚膜肿胀试验, 可在短时间内完成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。
1．立项依据与研究内容1.1 项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。
炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。
其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。
人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。
人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌(芽孢型)尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。
该病潜伏期约7 天，但彻底发病多达60 天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障碍和痉挛。
由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。
一旦发病，病人在几天内就会死亡。
因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状的辨别对临床和治疗有着重大的意义。
如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等[2] 。
1.2 项目的研究内容炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为～ 1. 5um× 3～5um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。
在病人、病畜体内多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜(红色)。
炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。
炭疽诊断标准
乙类传染病按甲类管理炭疽【GB 17015—1997】1 诊断依据1．1 流行病学病人生活在已证实存在炭疽的地区内，或在发病前14日内到达过该类地区；从事与毛皮等畜产品密切接触的职业；接触过可疑的病、死动物或其残骸，食用过可疑的病、死动物肉类或其制品；在可能被炭疽芽孢杆菌污染的地区从事耕耘或挖掘等操作，均应作为流行病学线索。
1．2 临床表现1．2．1 体表感染型（皮肤）炭疽：在面、颈、手或前臂等暴露部位的皮肤出现红斑、丘疹、水疱，周围组织肿胀及浸润，继而中央坏死形成溃疡性黑色焦痂，焦痂周围皮肤发红，肿胀，疼痛不显著。
引流该部位的淋巴结肿大且常化脓，伴有发热、头痛、关节痛等。
少数严重病例，局部呈大片水肿和坏死。
1．2．2 经口感染型（肠）炭疽：急性起病，发热，腹胀，剧烈疼痛，腹泻，通常为血样便或血水样便。
可有恶心、呕吐，呕吐物中含血丝及胆汁。
可累及消化道以外系统。
1．2．3 吸入感染型（肺）炭疽：高热，呼吸困难，可有胸痛及咳嗽，咯粘液血痰。
肺部体征常只有散在的细湿罗音。
X 射线的主要表现为纵膈影增宽。
常见胸腔积液。
1．2．4 脑膜炎型炭疽：可继发于1．2．1～1．2．3各型，也可能直接发生。
剧烈头痛，呕吐，项强，继而出现谵妄、昏迷、呼吸衰竭，脑脊液多为血性。
1．2．5 炭疽败血症：可继发于1．2．1～1．2．3各型，也可能直接发生。
严重的全身中毒症状，高热、寒战，感染性休克与弥漫性血管内凝血（DIC）表现，皮肤出现出血点或大片淤斑，腔道中出现活动性出血，迅速出现呼吸与循环衰竭。
在循环血液中可检出大量炭疽芽孢杆菌。
1．3 实验室检查结果1．3．1 皮肤损害的分泌物，痰、呕吐物、排泄物，或血液、脑脊液等标本中，显微镜检查发现炭疽芽孢杆菌。
1．3．2 细菌分离培养获炭疽芽孢杆菌（详见附录A）。
1.3．3 血清抗炭疽特异性抗体滴度出现4倍或4倍以上升高（详见附录B）。
2 诊断2．1 疑似病例诊断具有1．2．1典型皮肤损害，或具有1．1流行病学线索，并具有1．2．2～1．2．5的临床表现之一者。
炭疽杆菌的快速检验方法概要
炭疽杆菌的快速检验方法核心提示：本标准适用于进行动物皮张、原毛炭疽杆菌的检验。
1设备和材料1.1天平。
1.2温箱36℃±1℃。
1.3震荡器。
1.4显微镜。
1.5灭菌三角烧瓶。
1.6离心机。
1.7离心管1.8平皿。
1.9接种棒、镍铬丝...本标准适用于进行动物皮张、原毛炭疽杆菌的检验。
1设备和材料1.1天平。
1.2温箱36℃±1℃。
1.3震荡器。
1.4显微镜。
1.5灭菌三角烧瓶。
1.6离心机。
1.7离心管1.8平皿。
1.9接种棒、镍铬丝。
1.10L-型玻棒。
2培养基和试剂2.1 5%绵羊血琼脂平板培养基。
2.2营养琼脂平板培养基。
2.3活性炭NaHCO琼脂平板培养基。
3溶液(现用现配为宜)。
2.3.1 7%NaCO32.3.2 10%活性炭末悬液,炭末越细越好,配好后0.105Mpa(121℃)灭菌20min备用。
临用前隔水煮沸数分钟。
2.3.3取172ml普通营养琼脂培养基,稍冷后加入10%活性炭末悬液(摇溶液20ml,最终浓度为0.7%,混匀倾注匀)8ml,最终浓度为0.4%再加入7%NaCO3平板。
3操作步骤3.1样品的处理先将皮毛剪碎,称取3g左右放入灭菌三角瓶中,加入适量的0.5%洗涤液以充分浸泡为宜(用5%漂白粉溶液洗涤也可),人工或机械振荡10-15min后静止10min,取悬液10ml加入离心管中,2000rpm离心10min,弃上液,再加入3-5ml灭菌蒸馏水,于65℃水浴30min。
3.2分离培养取水浴后混悬液0.05ml接种于血平板中,用L型玻棒涂匀(L型玻棒需酒精火焰灭菌),37℃培养18-24h。
3.3签定3.3.1菌落特征典型菌落:菌落呈扁平,不透明,表面干燥,粗糙,有微细结构,边缘不整齐,似狮子头状(卷发状),常带有逗号状小尾突起的粗糙型(R)较大菌落,菌落直径为2-3mm,呈灰白色,在血平板上溶血。
拉丝现象:用接种针挑起幼龄菌落时,有粘性呈“拉丝状”而其他需氧芽胞杆菌少见。
炭疽芽胞杆菌的鉴定分析
炭疽芽胞杆菌的鉴定分析发表时间：2016-08-03T14:08:47.933Z 来源：《医药前沿》2016年7月第21期作者：刘丽鑫[导读] 炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)俗称炭疽杆菌，是炭疽病的病原菌，为人、畜共患性疾病，常在牧区暴发流行。
刘丽鑫（黑龙江省农垦北安管理局中心医院黑龙江农垦 164000）【摘要】探讨炭疽芽胞杆菌的微生物学检验的方法与鉴定。
炭疽芽胞杆菌是炭疽病的病原菌，炭疽病的病原菌，为人、畜共患性疾病，快速有效的检验和鉴定炭疽牙孢杆菌是最为重要的。
采取直接涂片染色镜检，分离培养与鉴定及药物敏感试验方法进行检查。
快速的病原学诊断在控制疾病流行中有重要意义。
【关键词】炭疽牙胞杆菌；微生物学；检查方法【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）21-0397-02炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)俗称炭疽杆菌，是炭疽病的病原菌，为人、畜共患性疾病，常在牧区暴发流行。
由于炭疽杆菌宿主广泛，传播方式多样，芽胞的抵抗力极强，故恐怖分子可利用该菌制造“生物恐怖”危害人类。
炭疽芽胞杆菌是需氧芽胞杆菌属中致病力最强的革兰阳性大杆菌。
引起人与动物炭疽病。
1.炭疽芽胞杆菌的生物学特性1.1 形态与染色本菌为致病性细菌中最大的革兰阳性杆菌。
大小为5～10μm×1～3μm，两端平切，无鞭毛。
新鲜标本直接涂片常单个存在或呈短链。
经培养后则形成长链，呈竹节状排列。
细菌在有氧条件下可形成芽胞，芽胞小于菌体、椭圆形、位于菌体中央。
有毒菌株可有明显的荚膜。
1.2 培养特性本菌为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，最适生长温度为30～35℃。
无毒菌株在普通琼脂培养基上形成灰色、扁平、干燥、粗糙型(R)菌落，低倍镜下观察菌落边缘呈卷发状。
在血液琼脂平板上培养12～15h菌落周围不溶血，24h后有轻度溶血[1]。
在肉汤培养基中由于形成长链而呈絮状沉淀生长。
在明胶培养基中37℃培养18～24h，由于细菌沿穿刺线向四周扩散生长，使明胶表面液化成漏斗状。
炭疽杆菌快速鉴定
炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10生物技术3班 0326摘要杆菌（Bacillus anthraci）属于需氧杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。
炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。
平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。
皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。
我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性,再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC03平板CO2培养物的荚膜肿胀试验,可在短时间内完成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。
1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。
炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。
其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。
人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。
人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌（芽孢型）尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。
该病潜伏期约7天，但彻底发病多达60天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障碍和痉挛。
由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。
一旦发病，病人在几天内就会死亡。
因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状的辨别对临床和治疗有着重大的意义。
如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等[2]。
1.2项目的研究内容炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为～1. 5um×3～5um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。
在病人、病畜体内多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜（红色）。
炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。
最适pH为～。
在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。
炭疽的诊断标准
炭疽的诊断标准
炭疽是一种由炭疽芽孢杆菌引起的急性、发热、皮肤疮痍和脓毒症的传染病。
本文介
绍炭疽的诊断标准：
1. 临床表现
炭疽的临床表现包括剧烈发热、恶寒、头痛、肌肉痛、乏力等非特异性症状，以及皮
肤疱疹、水疱、溃疡和淋巴结肿大等外部症状。
病程短暂，一般在1-2周内出现病情急剧
恶化和危及生命的全身症状。
2. 病原体检测
炭疽芽孢杆菌的检测可通过细菌培养、直接荧光抗体法、PCR检测、免疫荧光等方法
来进行。
3. 血液检测
在炭疽感染的早期阶段，血培养通常是阴性的，但脓毒症时血培养通常为阳性。
血清
特异性抗体IgM和IgG可在感染后1周内升高，IgG可升高数年。
4. 影像检查
CT和MRI可以观察皮肤、淋巴结、肺、肝、脾、肾等器官的情况，并可辅助诊断。
5. 确定暴露史
炭疽是由自然暴露或人为暴露而感染的，确定暴露史包括挖掘地下水污染土壤、处理
动物皮毛、工厂生产、恐怖袭击等途径进行。
总之，炭疽病的诊断基于临床表现、病原体检测、血液检测、影像检查和确认暴露史。
诊断炭疽的确立需要综合评估病人的症状和体征，结合实验室检查，以得到准确的诊断。
因此，如果怀疑患有炭疽病，应尽快就医诊断。
炭疽芽孢杆菌检测鉴定技术研究进展
RIA 灵敏度高 (可测定 ng 或 pg 量) 、特异性好 、 样品用量少 (011 ml 左右) 、操作方法易标准化 。双 抗体夹心法及生物素亲和素系统的引入 ,既减少了 本底干扰 ,提高了实验灵敏度 ,又能缩短反应时间 , 而且可实现自动连续测定 。
RIA 也分为直接法和间接法 。直接与间接放射 免疫分析法检测固定于多点显微镜玻片的炭疽芽孢 杆菌的对比研究表明〔8〕: 直接检测法的缺点在于一 种标记物只能检测相应的抗原 (或抗体) ,使其使用 效果受到了一定的限制 ;间接法可以利用一种标记 物 ,即标记抗抗体 ,检测多种其它抗体 ,较直接法能 结合的抗体数目多 ,由此可增加敏感性 ,扩大了使用 范围 。间接法并不能增强信号强度 ,但信噪比增加 。 可用于监测超免疫状态实验动物的循环抗体 。 214 免疫荧光检测法
免疫荧光试验 ( IF) 用于炭疽与蜡样芽孢杆菌繁 殖体的鉴别表明〔9〕: 对于吸附反应能否完全消除交 叉反应 ,目前报道不一 。IF 与其他血清学诊断方法 相比优势在于 ,能检测菌群抗原异质性 。遗憾的是 , 人工微量流式记数速度太慢 ,敏感性也随之下降 。 为提高其敏感性 ,采用流式细胞记数仪进行记数 。
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炭疽杆菌的快速鉴定王艺钧10生物技术3班 201030700326摘要炭疽杆菌（Bacillus anthraci）属于需氧芽胞杆菌属，能引起羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。
炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。
平时，牧民、农民、皮毛和屠宰工作者易受感染。
皮肤炭疽在我国各地还有散在发生，不应放松警惕。
我们利用炭疽杆菌的特性，通过微生物学检查，观察炭疽杆菌在含血平板上幼稚菌落待征、溶血和粘性,再进行高价效噬菌体快速裂解试验、青霉素纸片串珠试验和活性炭NaHC03平板CO2培养物的荚膜肿胀试验,可在短时间内完成对炭疽杆菌的定性鉴定，而不需要对其深入分子水平的检测。
1．立项依据与研究内容1.1项目的立项依据炭疽热是一种古老的人兽共患传染病。
炭疽是由炭疽杆菌引起的人兽共患急性、热性、败血性传染病。
其病理变化的特点是脾脏显著肿大，皮下及浆膜下结缔组织出血浸润，血液凝固不良，呈煤焦油样。
人感染后多表现为皮肤炭疽、肺炭疽及肠炭疽，偶有伴发败血症。
人类炭疽病是由于接触病畜的皮毛、吸入带病菌（芽孢型）尘埃，或进食未煮熟的病畜肉类而感染。
该病潜伏期约7天，但彻底发病多达60天，早期症状包括咳嗽，但很快会发展为严重的呼吸障碍和痉挛。
由于炭疽病起初的症状类似流感，非常容易被人忽略。
一旦发病，病人在几天内就会死亡。
因此，快速检测出炭疽杆菌和有炭疽杆菌引起的症状的辨别对临床和治疗有着重大的意义。
如今，炭疽杆菌的鉴别技术已近很成熟，如：免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等[2]。
1.2项目的研究内容1.2.1炭疽杆菌的特点革兰氏阳性细菌；长而直的大杆菌，菌体两端平直；大小为1.0～1. 5um×3～5um，致病菌中最大的；无鞭毛，不能运动。
在病人、病畜体内多散在或呈2～3个短链排列，有荚膜（红色）。
炭疽杆菌为兼性需氧菌，在12～44℃都能生长，最适生长温度为37℃。
最适pH为7.3～7.6。
在活炭疽病畜体或死亡后未经解剖的尸体内，不形成芽胞。
一旦体内炭疽杆菌暴露于空气中，接触了游离氧，在一定温度下(12--42℃)就会形成芽胞。
芽胞呈卵圆形或圆形，位于菌体中央或稍偏向一端。
1.2.2分离特性从临床患者和病畜标本中分离炭疽芽孢杆菌是比较简便的,但从环境样品中分离和鉴定芽孢则相对较困难 ,主要是缺乏有效的富集方法 ,环境样品中含有其它形成芽孢的需氧菌 ,它们的过度生长可干扰芽孢发芽或干扰检测。
气溶胶释放后 ,对污染区人或动物的采样 ,采集鼻腔、面部、头发内的样品最为重要。
芽孢的如下特性有利于芽孢从环境样品中的分离[3]: ①芽孢耐热:样品前处理时可以加热 63～65 ℃20 min杀死大部分繁殖体 ,并促进芽孢发芽;②芽孢耐乙醇:样品前处理时可以用 50 %乙醇处理1 min杀死大部分繁殖体 ,因此从环境样品中分离芽孢并不受细菌繁殖体污染的干扰; ③芽孢的浮力较大:我们可以用蔗糖或双相甘油-水分离芽孢。
另外 ,芽孢的疏水性使之与土壤颗粒结合紧密 ,给分离带来了困难 ,因此 ,分离芽孢时一般用非离子型去垢剂减少这种紧密结合 ,提高分离效率。
分离后的炭疽杆菌接种到LB培养基，注意无菌低温4度保存，以备鉴定。
1.2.3培养特性炭疽杆菌幼稚菌落:(1)呈典型狮子头状,边缘不整齐,常有小尾突起,(2)均不溶血;(3)菌落有粘性,用接种针挑取,拉丝现象明显。
选择这样的典型菌落是顺利进行菌种鉴定的先决条件。
因此必须控制分离平板的孵育时间。
血平板在37℃中孵育12~15小时即可，孵育时间愈长,炭疽杆菌在平板上的菌落特征愈不明显。
在碳酸氢钠的培养基中，孵育于CO2环境下，也能形成荚膜，形成荚膜是毒性特征，有毒株在碳酸氢钠平板，20%CO2培养下，形成粘液状菌落（有荚膜），而无毒株则为粗糙状。
在普通琼脂平皿培养基上生长成不透明、灰白色、扁平、表面粗糙的菌落，边缘不整齐，能形成几个或数十个菌体相连的长链，低倍显微镜观察呈卷发状。
在血液琼脂平皿培养基上，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。
1.2.4最终鉴定在大多数情况下,炭疽芽孢杆菌的鉴定是比较容易的。
血琼脂培养基上的菌落形态具有很重要的鉴定意义 ,例如 ,表面无光泽、菌落扁平、白色或灰白色、不溶血及边缘呈卷发状等;如果加上其它一些培养特征 ,如无动力、青霉素敏感、噬菌体裂解、在含碳酸氢钠的血琼脂培养基(5 %～20 %CO2)上形成荚膜等 ,就可以认为这一菌株是具有毒力的炭疽芽孢杆菌 ,其余的生化测试意义不大。
而通过PCR技术扩增荚膜和毒素基因也可以达到鉴定的目的[1]。
对不典型荚膜可以用 McFadyeans’ s试验鉴别:将可疑菌落与数毫升血液混匀 ,37 ℃孵育 4 小时 ,然后做血涂片 ,热和酒精固定后 ,用亚甲蓝 ( Poly2chrome emthylene blue)染色 ,炭疽芽孢杆菌染成黑色 ,荚膜染成粉红色。
虽然已发现一些炭疽芽孢杆菌的菌株不能产生荚膜 ,甚至还有人报道发现可产生荚膜而不产生毒素的炭疽菌株。
事实上 ,如果一个菌株满足上面的鉴定指标 ,而只是荚膜或毒素阴性 ,仍然可以鉴定为炭疽芽孢杆菌。
1.2.4参考文献[1] Turnbull P C B. Definitive identification of Baci llus anthracis 2a[2] 杨瑞馥 ,韩延平 ,宋亚军 ,杜宗敏 ,翟俊辉 ,甄蓓等.炭疽芽孢杆菌检测鉴定技术研究进展 [J] 微生物学免疫学进展 2002 年第 30 卷第 2 期:53-66[3] Hail S , Rossi CA ,Luding GV , et al . Comparison of noninvasive sampling sites for early detection of Bacil lus anthracis spores f rom rhesus monkeys after aerosol exposure〔 J〕 . Mil Med 1999 ; 164(12) :8332837.1.3研究方案1.3.1研究思路提取样品→显微镜观察→血琼脂培养基鉴定、营养培养基鉴定、青霉素串珠实验、噬菌体裂解和青霉素敏感实验、碳酸氢钠平板鉴定。
1.3.2标本采集和样品处理我们以土壤标本为样品，在牲畜死亡或宰杀的地点，应取土壤标本以供检查。
一般要采集表层土壤（10cm内），取150g左右。
①样品加热 63～65 ℃20 min杀死大部分繁殖体 ,并促进芽孢发芽；②样品用 50 %乙醇处理1 min杀死大部分繁殖体 ,因此从环境样品中分离芽孢并不受细菌繁殖体污染的干；③用蔗糖（用量不能太多）溶解；④离心取上清液（1000rcf/min），溶于LB培养基中，培养至OD600nm值为0.8~1.0，因为在这时候是菌体较多的时候，又不在衰老期，在4℃保存，备用。
1.3.3显微镜检查步骤：涂片、革兰染色及荚膜染色、显微镜检查。
取末稍血液制成涂片后，染色镜检，发现有多量单在、成对或2～4个菌体相连的短链排列、竹节状有荚膜的粗大杆菌，即可初步认为有炭疽杆菌。
因为血液中应为无菌，所以如在血液内有特征明显的菌，则可初步确定为炭疽杆菌。
1.3.4血琼脂培养基的鉴定取血琼脂平板、营养琼脂平板，制备好的菌液各涂布0.1ml，在37℃中孵育12~15小时，观察培养情况。
由上面的特性可知，在营养琼脂平板中，炭疽杆菌粗糙不发光，比较扁平，有点儿象蜡样杆菌的菌落但较小，卷发状，有的菌体形态不规则，有彗星状拖尾，白或灰白色；在血琼脂平板中，生长出湿润粘稠的菌落，菌落周围不溶血。
如果出现这种情况，即可更进一步判断为炭疽杆菌，否则，可以排除炭疽杆菌。
结果参考：血平板营养平板如果出现如图所示的结果，可以确定为炭疽杆菌。
如果实验结果出现溶血现象，或营养培养基上菌落异常，则可能是别的菌，或是平板遭到了污染。
1.3.5青霉素串珠试验用含有青霉素的小滤片纸(纸片蘸取每毫升含50~100u青霉素溶液或每片含1个u青霉素的干燥纸片均可),贴在涂有细菌的平板上,孵育4~6小时用显微镜直按观察。
由于青霉素由纸片向外扩散,总有一圈合适浓度使炭疽杆菌形成典型串珠,结果明显,观察方便。
因为炭疽杆菌对青霉素敏感，低浓度的青霉素（0.05～0.5单位/毫升）即可阻碍细胞壁的形成，不能保持正常的杆状外形。
培养4—6小时可以看串珠实验结果。
结果参考：如果在青霉素纸片的辐射范围内出现如图所示的串珠现象，则可以初步判断为炭疽杆菌，如果没有出现菌落，或是菌落形态异常，则可以排除为炭疽杆菌。
1.3.6噬菌体裂解和青霉素敏感性将制备好的菌液密集划线接种于平板上，在划线区内一处滴一诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片，纸片放下后，不能再动，37 ℃孵育8～24h后，观察结果。
如果在滴噬菌体处有透明噬菌体斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环，便宜可断定接种物为炭疽芽胞杆菌。
噬菌体实验中因蜡样芽孢杆菌可能会有假阳性，但因其对青霉素不敏感，所以两者同时做可以排除蜡样芽孢杆菌。
否则，结合以上几个实验，可以排除炭疽杆菌。
结果参考：青霉素平板碳酸氢钠平板1.3.7碳酸氢钠平板二氧化碳培养实验碳酸氢钠平板二氧化碳培养试验是鉴定炭疽杆菌及其毒力的重要项目。
碳酸氢钠培养基中加入0.4%活性碳,以促进荚膜早期形成，又用固体培养物浓厚地点种于平板表面。
二氧化碳浓度可用CO2培养箱增至20~40%,使用极为方便。
有毒力的炭疽杆菌于37℃孵育5小时即能生长荚膜。
取5小时培养物加以公鸡制备的高效价抗炭疽荚膜血清，在玻片上作荚膜肿胀试验,出现荚膜特异反应者为有毒力的炭疽杆菌。
因为炭疽杆菌的毒力、碳酸氢钠平板上生长的粘液状菌苔和炭疽杆菌的荚膜三者有平行关系,现将它们联合试验。
活性炭NaHCO,平板CO2培养5小时后,荚膜肿胀试验阳性的炭疽杆菌说明存在炭疽荚膜抗原成份,结合该菌在空气中培养生成粗糙的狮子头状菌落特点,可判断为炭疽毒株。
故荚膜肿胀试验不仅可测定细菌荚膜的抗原性,在一定条件下,可作为一种体外毒力试验。
如果长不出荚膜，则不是炭疽杆菌；如果出现粗糙状，则为无毒或毒性低的炭疽杆菌。
1.4可行性分析由于炭疽杆菌的研究比较深入和透彻，如今的炭疽杆菌的检测方法已达十几种，免疫学检验技术、核酸检验技术、适配子、肽核酸、生物传感器、生物芯片、化学分析技术、核酸测序与指纹图分析技术等等，但是有很多技术在如今我们学校的实验室可能不具备设备和条件。
所以对炭疽杆菌的检测，我们根据炭疽杆菌的特性设计实验，依然能够鉴别出炭疽杆菌。
对于准确的分子水平的PCR技术检测炭疽杆菌的pox1和pox2两个基因，只用这种方法就可以检测，但是如今PCR扩展要使用的引物由外面公司制备，从送出去序列到拿到引物，在这段时间里，我们已经可以把我们上述的实验完成了，所以PCR技术测核酸不符合我们所要求的快速检测。