非结核分枝杆菌菌种鉴定方法
DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展
非结核分枝杆菌(nontuberculous Mycobacteria, NTM)系指除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外的一大类分枝杆菌的总称。
NTM种类繁多,迄今已发现160余种,通常采用Runyon分类法(NTM在试管内的生长温度、速度、菌落形态和色素产生与光反应关系)将NTM分为光产色菌、暗产色菌、不产色菌及快速生长分枝杆菌4组[1]。
NTM广泛存在于自然环境中,主要通过水和土壤传播,极少数为致病菌,多数为条件致病菌,人通过环境接触感染NTM而患病[2-3]。
近期的研究显示,NTM的分离率由4.3%(1979年统计)上升至11.1%(2000年统计),再到21.0%(2010年统计)[4],这反映出我国的NTM病患者呈明显增多趋势。
NTM病与结核病的临床表现相似,多表现为全身中毒症状和局部损害,主要累及肺、淋巴结、皮肤及免疫受损患者,若能及时鉴定出菌种甚至亚种,可减少误诊,进而降低因误诊导致的不良后果[2,5]。
不同种类NTM感染采用的治疗方案亦不同,因此,明确NTM 是否感染及鉴定出准确的亚种是拟定最佳诊疗方案的关键。
NTM的实验室检测方法主要是传统细菌学检测和分子生物学检测,传统检测方法(培养基培养后辅以生化试验)因简单、试剂价格合理且易于推广而被沿用至今,但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性,不能准确、及时地为临床诊断提供参考[6]。
随着分子生物学技术的迅速发展,利用NTM同源DNA序列中的特异性可以鉴定其菌种甚至亚种,这为临床诊DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展陈培幸韶关学院医学院,广东韶关512005[摘要]非结核分枝杆菌(NTM)感染的患者数量逐年增加,同时,NTM新的亚种不断被发现,这导致其检测鉴定难度也随之增加。
迄今发现的菌种已有160余种,而传统检测方法(培养基培养后辅以生化试验)不能准确、及时地为临床诊断提供参考。
随着分子生物学技术的迅速发展,利用NTM同源DNA序列中的特异性(如16S核糖体DNA、核糖体蛋白S1、转录间区序列1、热休克蛋白65、rpo B等)可以快速鉴定菌种。
DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展
DNA测序鉴定非结核分枝杆菌的研究进展1. 引言1.1 背景介绍非结核分枝杆菌是一种常见的细菌，是导致一些肺部感染的主要病原体之一。
由于非结核分枝杆菌的增殖速度较慢，疾病的发展进程也较缓慢，因此经常导致诊断和治疗上的困难。
传统的检测方法包括培养和荧光染色技术，然而这些方法存在耗时长、操作复杂、准确性不高等缺点。
随着DNA测序技术的快速发展，研究人员开始将其应用于非结核分枝杆菌的鉴定和诊断。
DNA测序技术可以准确快速地鉴定非结核分枝杆菌的种类和亚种，有望解决传统方法的局限性。
DNA测序技术还可以帮助研究人员了解非结核分枝杆菌的耐药性、毒力和传播途径，为疾病的控制和预防提供重要的参考。
开展DNA测序技术在非结核分枝杆菌研究中的应用具有重要的意义和价值。
1.2 研究意义研究意义：非结核分枝杆菌是导致结核病以外的各种疾病的病原体，其种类繁多且耐药性强，给公共卫生和临床诊断治疗带来了很大挑战。
传统的分枝杆菌鉴定方法繁琐且耗时，往往不能满足快速、准确的检测需求。
而DNA测序技术的出现为非结核分枝杆菌的快速鉴定提供了新的可能性，具有高度的准确性和灵敏度。
通过对非结核分枝杆菌基因组进行测序分析，可以更准确地确定其种属和毒力基因，为疾病的防控和治疗提供重要的依据。
深入研究DNA测序技术在非结核分枝杆菌鉴定中的应用及其优势与局限性，对于提高疾病的早期诊断和治疗效果具有重要的意义。
本文旨在系统总结目前相关研究进展，分析影响因素，并展望未来研究的发展方向，以期为该领域的进一步探索提供参考。
2. 正文2.1 DNA测序技术在非结核分枝杆菌鉴定中的应用DNA测序技术已经成为非结核分枝杆菌鉴定领域中一种非常有效的工具。
通过DNA测序技术，可以准确地确定非结核分枝杆菌的物种和亚型。
在传统方法中，分枝杆菌的鉴定主要依赖于生化试剂盒检测和细菌培养，这些方法存在着较高的误差率和耗时较长的缺点。
而DNA测序技术则可以准确且快速地对非结核分枝杆菌进行鉴定，提高了鉴定的准确性和效率。
040分枝杆菌菌种鉴定标准规程
1.分枝杆菌菌种初步鉴定：1.1试剂：见培养基配制标准程序1.2 接种方法:与药物敏感试验相同，10-2mg／ml菌液，接种0.1ml。
37℃孵育，每周观一次，快速生长非结核分枝杆菌一周内可生长菌落，缓慢生长分枝杆菌，四周报告结果。
与药物敏感性试验同步进行。
1.3 结果与报告分枝杆菌菌种初步鉴定结果见表PNB TCH牛分枝杆菌 - -结核分枝杆菌 - +非结核分枝杆菌 + +参考文献:结核病诊断细菌学检验规程2.分枝杆菌菌种系统鉴定：临床分离分枝杆菌菌株，经PNB、TCH等鉴别培养基初步鉴定后，确定为非结核分枝杆菌者或药物敏感试验耐PAS的分离菌株，以及临床提出需作菌种鉴定的菌株，可按下列方法进行系统鉴定。
2.1 培养特性2.1.1 生长速度接种原始分离株的次级培养物10-2mg／ml菌液0.1ml于改良罗氏培养基上，分别置于37℃;45℃和28℃孵育，一周之内生长菌落者为快速生长分枝杆菌。
一周后生长者为缓慢生长分枝杆菌。
2.1.2色素产生将分离菌株接种两支改良罗氏培养基，一支用锡纸或黑纸包缠密封，另一支不包纸，二者一起放入37℃孵育，待不包纸管长出菌落时，开启包纸管观察，有色素产生为暗产色菌。
无色素者，开启试管胶塞通气，以100瓦钨灯泡在相距450cm处照射2—3h，继续放37℃孵育3天，每天观察一次，产生色素者则为光产色菌。
不论照光与否，菌落均无色素产生者为不产色菌。
2.2 生化试验2.2.2 耐热触酶试验（1）原理：有些分枝杆菌经68℃处理后，产生的过氧化氢酶仍保持活性，可分解过氧化氢。
（2）试剂：a)pH7.0 1／15M磷酸盐缓冲液(PB)b)30％过氧化氢溶液(H202)c)10％吐温一80溶液 121℃ 10min灭菌，4℃保存。
(3) 方法：取生长在改良罗氏培养基3—4周的菌落磨菌比浊制备10mg／ml 菌悬液，取0.5ml混悬于含试剂(1)1.0ml试管内，放入68℃水浴20min，待冷却后，缓缓滴加37％H202与10％吐温-80等量混合液0.5ml(此液临用前配制)。
非结核分枝杆菌病 诊断与处理详细讲解
非结核分枝杆菌病诊断与处理详细讲解非结核分枝杆菌病（Non-Tuberculosis Mycobacterium，简称NTM），是由非结核分枝杆菌引起的一类感染性疾病。
与结核病不同，NTM病往往在免疫功能低下的个体中发生。
NTM病病程相对较长，症状多样，通常不会自愈。
如果不及时进行诊断和治疗，将对患者的健康产生严重影响。
本文将详细讲解NTM病的诊断与处理。
一、诊断NTM病的诊断主要依靠以下几个方面：病史调查、临床表现分析、实验室检查以及影像学检查等。
1. 病史调查：患者的个人病史对于NTM病的诊断非常重要。
医生需要了解患者的基本信息、既往病史以及可能的风险因素，例如是否有免疫功能低下等。
2. 临床表现分析：NTM病的临床表现多样，常见的症状包括咳嗽、咳痰、乏力、发热等。
这些症状不容忽视，特别是对于长期咳嗽伴有咳痰的患者。
医生需要结合患者的具体表现来判断是否需要进行NTM病的进一步检查。
3. 实验室检查：实验室检查是确定NTM病诊断的重要手段之一。
目前常见的实验室检查方法有痰液培养、DNA检测、中和试验等。
其中痰液培养是最常用的检查方法，可以通过培养痰液样本中的分枝杆菌来确定是否感染NTM。
此外，DNA检测和中和试验也可以用来确认NTM病的诊断。
4. 影像学检查：影像学检查在NTM病的诊断中起到重要的辅助作用。
常见的影像学检查方法有X线胸片、胸部CT等。
NTM病在影像学上通常表现为肺部或其他器官的结节、空洞、磨玻璃样阴影等。
医生可以通过影像学检查来确定病变的范围和程度，为进一步治疗提供依据。
二、处理NTM病的处理主要包括药物治疗、免疫调节治疗以及手术治疗等。
具体处理方案应根据患者的具体情况来制定。
1. 药物治疗：药物治疗是NTM病的主要治疗方法。
常用的抗生素有环丙沙星、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酮等。
治疗方案应根据病原菌的类型、感染部位、药敏试验结果以及患者的肝肾功能等因素来确定。
药物治疗一般需要长期进行，通常持续数月甚至数年。
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
3
分子生物学方法
该方法准确度高、速度快，但需要昂贵的仪器 和试剂，且操作复杂。
实验数据的处理方式
数据分析
利用统计学方法和计算机技术对 实验数据进行处理和分析，以获 得更准确的鉴定结果。
数据标准化
将实验数据进行标准化处理，以 消除误差和偏差，提高数据质量 。
数据可视化
将实验数据进行可视化处理，以 直观地展示数据变化趋势和结果 ，方便实验人员分析和比较。
双向电泳鉴定
总结词
双向电泳是一种分离蛋白质混合物的方法，通过在两个方向上对蛋白质进行 电泳分离，从而获得蛋白质的详细信息。
详细描述
在双向电泳中，蛋白质首先在第一个方向上进行电泳分离，然后在第二个方 向上进行电泳分离。这样可以获得蛋白质的详细信息，如分子量、等电点、 糖基化等，从而进行蛋白质鉴定。
蛋白质芯片鉴定
THANKS
基因芯片鉴定具有高灵敏度、高特异性、可重复性好等优 点，适用于临床和环境样本中多种细菌的鉴定。
04
蛋白质分析鉴定方法
质谱鉴定
总结词
质谱鉴定是一种常用于蛋白质分析的方法，通过将蛋白质离 子化并将其引入质谱中进行测量，从而获得蛋白质的结构和 相对分子质量等信息。
详细描述
质谱鉴定的原理是将蛋白质分子电离并使其进入磁场或电场 中运动，根据其质量和电荷比值的不同，形成不同的离子峰 。通过对离子峰的分析，可以获得蛋白质的结构和相对分子 质量等信息，从而进行蛋白质鉴定。
05
比较分析鉴定方法
进化树比较鉴定
总结词
同源性分析、遗传距离分析、系统发生树构建
详细描述
通过序列比对，找出非结核分枝杆菌菌种间的遗传差异，构建进化树，根据 菌种在进化树上的亲缘关系进行鉴定
非结核性分枝杆菌病,非结核性分枝杆菌病的症状,非结核性分枝杆菌病治疗【专业知识】
非结核性分枝杆菌病,非结核性分枝杆菌病的症状,非结核性分枝杆菌病治疗【专业知识】疾病简介非结核性分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)系指分枝杆菌属中，除结核分枝杆菌复合群(人型、牛型、非洲型和田鼠型结核分枝杆菌)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，由NTM引起的疾病称为非结核性分枝杆菌病(disease caused by NTM)。
近年来由于检出率逐渐增多，相应的对其引起的各种疾病的认识也在逐渐提高。
非结核性分枝杆菌中大多数为腐物寄生菌，毒力低，属于条件致病菌。
非结核性分枝杆菌病的症状可有肺内、肺外之分，肺外感染可涉及皮肤、骨骼和淋巴结等。
疾病病因一、发病原因NTM以前曾命名为副结核杆菌、假性结核菌、无名分枝杆菌、未分类分枝杆菌、野种分枝杆菌、机会性分枝杆菌、非典型抗酸杆菌等。
NTM迄今已发现有100多种，其中37种已见致病病例的报道。
根据伯杰系统细菌学手册(Bergys manual of systematic bacteriology)将NTM分为快速生长型和缓慢生长型两大类，其中经国际细菌命名委员会审定的42种。
NTM广泛分布于自然界的土壤、尘埃、流水和生牛奶中。
显微镜下NTM形态与结核杆菌相似，抗酸染色呈红色，但在培养、生化特性与结核杆菌不同。
可根据NTM在固体培养基上的生长速度与光线对其产生色素的影响，Runyon分类法则将其分为以下四个群：Ⅰ群为光产色菌(photochromogen)，有堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌及亚洲分枝杆菌等，其中前两种为致病菌。
Ⅱ群为暗产色菌(scotochromogen)，有瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌。
Ⅲ群为不产色菌(achromatic mycobaterium) ，有鸟分枝杆菌复合群(M.avium complex，MAIC)、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、嗜血分枝杆菌(M.hemophilum)、土地分枝杆菌。
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
基于表型特征的鉴定方法传统生物学鉴定法基于菌落形态、染色特性、生化反应等表型特征进行鉴定鉴定时间长，主观误差较大自动化仪器鉴定法基于自动化仪器检测进行菌种鉴定，提高准确性和效率仪器成本高，普及程度有限基于分子生物学的鉴定方法基于基因序列的鉴定法对菌种进行基因序列分析，比对已知基因型，确定菌种分类准确度高，可检测未知菌种基于基因芯片的鉴定法利用基因芯片技术检测菌种的特异性和基因表达情况快速简便，可检测多种菌种
xx年xx月xx日
非结核分枝杆菌的菌种鉴定方法课件
CATALOGUE
目录
绪论基础知识非结核分枝杆菌的分离与培养生理生化鉴定分子生物学鉴定临床意义与防治策略复习与思考
绪论
01
1
课程背景
2
3
非结核分枝杆菌（NTM）的感染病例逐年增加
NTM对常用抗结核药物产生多重耐药性，治疗难度大
菌种鉴定对于诊断NTM感染、指导治疗和防控传播具有重要意义
诊断和治疗
02
提高诊断准确性，及时采集标本进行培养、分离、药敏试验等；根据药敏试验结果选择敏感抗生素治疗，并密切监测病情变化。
耐药性监测
03
建立耐药性监测系统，及时发现和隔离耐药菌株，控制耐药性的传播。
疫苗研究
研究新型疫苗，提高疫苗的保护效果和覆盖面。
耐药性机制
深入研究耐药性产生和传播机制，为耐药性的防控提供理论依据。
非结核分枝杆菌的分布
广泛存在于自然环境中，如土壤、水源、动物等。
非结核分枝杆菌的种类与分布
菌种鉴定基本流程
通过培养基分离纯培养物。
菌种分离
初步鉴定
生理生化鉴定
分子生物学鉴定
根据菌落特征、细胞形态等初步判断菌种类型。
进行一系列生理生化实验，如氧化酶试验、硝酸盐还原试验等，进一步确定菌种类型。
非结核分枝杆菌的实验室鉴定方法学进展
侵犯人体肺脏 、 淋 巴结 、 骨骼 、 关节 、 皮 肤 和 软 组 织 等组 织 器 官 ， 并 可 引起 全 身 播 散 性 疾 病 。 近 年 来 ， 由 于 ＡＩ Ｄ Ｓ患 者 、 长 期 使
ｍＩ 为 实验 界 限浓 度 ， 并辅以 ２ ８℃ 生 长 试 验 ， 耐 ６ ８ ℃热 触 酶 试
１ ． ２ ． １ Ｐ Ｃ Ｒ － 寡核苷酸探 针阵列技术
Ｐ Ｃ Ｒ 一 寡 核 苷 酸 探 针 阵
列 技 术 借 助 反 向 斑 点 杂 交 核 酸 分 子 杂 交 配 对 的 特 性 对 ＤＮ Ａ 样 品的 序 列 信 息 进 行 分 析 。 梁 建 琴 等 Ⅲ ７ 先 通过 Ｐ Ｃ Ｒ — Ｓ Ｓ Ｃ Ｐ初 步分析 鉴定 ２ ５ ３株 分 枝 杆 菌 临 床 分 离 株 ， 再根据 １ ６ Ｓ ｒ ＲＮ Ａ Ｐ Ｃ Ｒ 一 寡核苷酸探针 与待测菌 株生物 素标记 的 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ ＮＡ 基 因
非结核分枝杆菌 （ ＮＴ Ｍ） 是指 除结核 分枝杆 菌复合 群 （ 人
型、 牛型 、 非 洲 和 田 鼠分 枝 杆 菌 ） 及 麻 风 分 枝 杆 菌 以外 的 其 他 分 枝 杆菌， 是一种 条件 致病 菌 ， 极 易 导 致 院 内感 染 。 Ｎ ＴＭ 可 以
菌株和 １ ６ 株分枝杆菌临床分离菌株 １ ６ Ｓ － ２ ３ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ Ｉ Ｔ Ｓ测 序 ， 利用 １ ６ Ｓ － ２ ３ Ｓ ｒ ＤＮ Ａ 内转 录间 隔 区 序 列 既有 高度 保 守 的属 特 异 性 序 列 又有 高度 可变 的种 特 异 性 序 列 的 特点 ， 设 计 种 特异 性 引物 ， 并 以此 序 列 为 靶 基 因 ， 经Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 后 形 成 ３ 末 端带 有 荧光标 记 的相 差 一 个 碱 基 的不 同 长 度 的 产 物 ， 由于 １ ６ Ｓ － ２ ３ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ Ｉ ＴＳ序 列 长 度较 短 ， Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 产 物 一 次 测 序 可 获 得 全序列 ， 含有足够信息 ， 再 构 建 分 枝 杆 菌菌 种 聚类 分 析 树 状 谱 ， 进行核苷酸序列分析 ， 即 可 鉴 别 ＭＴ Ｂ 与 ＮＴ Ｍ 。直 接 测 序 法 操 作 易 于 标 准 化 与 自动 化 ； 利用 对 １ ６ Ｓ － ２ ３ Ｓ ｒ Ｄ ＮＡ Ｉ Ｔ Ｓ序 列 的