青花菜BZR1、BES1转录因子的克隆与功能分析
白菜WRKY转录因子cDNA片段的克隆及分析
白菜WRKY转录因子cDNA片段的克隆及分析王彦华1,2 侯喜林1∗ 史公军1（1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京210095；2. 河北农业大学园艺学院，保定071001）摘要：根据GenBank中登录的拟南芥WRKY转录因子的保守序列设计引物，采用RT-PCR和3’-RACE方法，从SA处理的不结球白菜抗病自交系苏州青中，获得了473bp的 cDNA片断。
序列分析表明，该序列含有WRKY转录因子共有的WRKYGQK保守结构域，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为83%，与拟南芥AtWRKY60同源性为72%，表明已经成功克隆了不结球白菜WRKY1基因3’末端cDNA序列，在GenBank中登录号为AF518555。
关键词：不结球白菜；水杨酸；WRKY转录因子；RT-PCR；RACE1.引言转录因子与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，或与其它蛋白共同作用激活或抑制目标基因的转录。
WRKY转录因子是一类含有WRKY等氨基酸的锌指蛋白，到目前为止，仅在植物中被发现[1]。
WRKY蛋白含有一个或两个十分保守的WRKY区域，但在保守域外基因间的同源性较低。
研究表明，WRKY蛋白能与核心序列为(T)TGAC的W盒顺式元件结合，而W盒存在于许多抗病基因的启动子中；而且，WRKY蛋白能够被病原菌及水杨酸（SA）快速诱导，说明WRKY基因在植物抗病信号途径中具有重要作用[2,3]。
从上个世纪九十年代中期以来，这类基因已在拟南芥、欧芹、甘薯、马铃薯、烟草、水稻等植物中被克隆[4]，但在芸薹属蔬菜上，未见报道。
本研究参照已发表的拟南芥WRKY转录因子基因序列设计简并引物，以SA处理后4h的不结球白菜为实验材料，通过RT-PCR和快速扩增cDNA末端（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）方法获得不结球白菜WRKY转录因子3’末端cDNA序列，为进一步克隆该转录因子全长cDNA奠定基础。
青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析
青花菜BoMYB基因的克隆与序列分析作者：项展恺来源：《种子科技》2019年第01期摘; ;要：通过培养青花菜幼苗并提取DNA，以所得DNA为模板克隆青花菜MYB基因，并对该基因进行测序。
测序后，利用生物信息学手段进行序列分析，包括寻找同源序列、同源序列蛋白质翻译比对、分析翻译所得蛋白质的理化性质和二级结构，预测结构域和构建系统发育树。
从青花菜中克隆得到的BoMYB基因，其编码263个氨基酸，蛋白序列中具有2个SANT结构域。
对比在拟南芥中的研究推测，该基因可能在渗透胁迫响应中起作用。
系统发育分析结果表明，BoMYB与欧洲油菜的MYB聚为一组，它们与拟南芥的MYB处于不同分支。
对BoMYB基因的克隆与序列进行分析，为探究青花菜MYB基因的表达、功能及抗逆机理研究奠定了基础。
关键词：青花菜;MYB基因;克隆;序列分析文章编号： 1005-2690（2019）01-0112-03; ; ; ;中图分类号： S635.3; ; ; ;文献标志码： B青花菜（Brassica oleracea var. italica），又名西兰花、绿花菜，是市场上常见的蔬菜之一，浙江台州是我国的青花菜主产地，建有全国最大的青花菜生产中心，是当地菜农出口创汇的重要蔬菜作物。
植物在生长发育过程中，經常会受到外界不良环境的影响，如干旱、水涝、病虫害等，导致生长受阻。
青花菜也一样，在整个生育期中受多种因子的胁迫，引起产量和品质下降，最终影响菜农的收入。
MYB转录因子是植物中最大的转录因子之一，其不仅在调节植物次生代谢[1]、细胞分化、细胞周期[2]以及叶片等器官形态建成中发挥作用，还在植物生长发育及抗逆境胁迫过程中起着极其重要的作用，如拟南芥AtMYB2受ABA诱导表达，并与RdBPI蛋白相互作用协调Rd22的表达，从而提高植物的抗逆境能力[3]等。
当植物受到干旱、低温等非生物因素胁迫时，会诱导MYB转录因子的表达，并通过结合相应的顺式作用元件，激活并调控下游基因的表达，从而对植物的抗逆能力产生影响[4]。
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析
青花菜病程相关蛋白基因BOPR1的克隆与表达分析作者：何佳葛露霞金魏佳范灵希章燕如叶佳燕郑颖蒋明来源：《福建农业学报》2018年第01期摘要：病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）是参与植物抗病性的重要物质，在诱导系统抗性过程中起着重要作用。
本研究以青花菜为材料，在克隆BoPR1基因的基础上，利用荧光定量PCR技术研究它们在根肿菌和核盘菌侵染下的表达模式。
序列分析结果表明，BoPR1基因组全长为489 bp，无内含子，编码162个氨基酸，具1个信号肽和1个SCP结构域。
系统发育分析的结果表明，BoPR1与甘蓝型油菜和白菜的PR1遗传距离最小，亲缘关系最近，在进化树上聚为一组；与醉蝶花PR1遗传距离最大，亲缘关系最远。
荧光定量PCR结果显示，BoPR1基因的表达受根肿菌诱导，在接种5d时的表达量最高，为对照的11.84倍；BoPR1基因的表达则不受核盘菌诱导。
关键词：青花菜；BoPR1；基因克隆；表达分析青花菜Brassica oleracea var.italica又名西兰花、茎椰菜、绿菜花和青花苔等，为十字花科CrUCiferae芸薹属一年生或两年生草本蔬菜。
青花菜以花茎和花球为食用部位，因富含蛋白质、维生素、矿物质、类黄酮和硫苷类等物质，深受消费者的青睐。
浙江省是我国青花菜的主产省，年种植面积达1万多h㎡，已成为菜农收入的重要来源。
随着种植年限的不断增加，各种病害如根肿病和菌核病等日益严重，它们危害根、茎、叶或花球，造成青花菜的产量和品质下降。
植物在长期的进化过程中，形成了一整套高度有效的防御机制，在与病原菌的互作过程中，植物通过启动抗病相关基因的表达以增强抵抗能力。
病程相关蛋白（Pathogenesis-related protein，PR）基因是参与这一过程的重要成员，在植物诱导抗性中起着重要作用。
PR基因的诱导、表达及其生物学功能的发挥是一个较复杂的过程，研究其在不同病原菌胁迫下的表现具有十分重要的意义。
白菜上皮硫特异蛋白基因克隆与功能验证
ｃ ｎ ａｎ ｎ ｅ ｏ ｄ ｒ ｔ ｂ ｌ ｅ ｈ ｔｍａ ｎ ｙ ｏ ｃ ｒ ｉ ｒ ｐ ｅ ｏ ｇ ｎ ｏ ｔ ｅ ｆ ｍｉ ｆＢｒ ｓ ｉａ ｅ ｅ ｏ ｔ ｉ ｉ ｇ ｓ ｃ ｎ ａ ｙ ｍｅ ａ ｏ ｉ ｓ ｔ ａ ｉ ｌ ｃ ｕ ｎ ｃ ｏ ｓ ｂ ｌ ｎ ｉｇ ｔ ｈ ａ ｌ ｏ ａ ｓｃ ｃ ａ ．Ｔｈ ｙ ｃ ｎ ｂ ｔ ｙ ｅ ａ ｅ
白菜 上 皮硫 特 异 蛋 白基 因克 隆 与功 能 验 证
孙 海 燕 ， 高峰 ，汪 俏 梅 袁
（ ． 江海 洋 学 院 食 品 与 药 学 学 院 ， 江 舟 山 ３ ６ ０ ； １浙 浙 １ ０ ４
２ 浙 江 大学 园 艺 系 农 业 部 园 艺 植 物 生 长 发 育 与 品质 控 制 重 点 开 放 实 验 室 ， 江 杭 州 ３ ０ ５ ） ． 浙 １ ０ ８
关 键 因 ；异硫 代 氰 酸 盐 ；过 量 表 达 上 中图分类号 Ｑ ９ ３ ２ Ｑ ４ ． ４ ． ； ９ ６ ８ 文献标志码 Ａ
Ｃｌ ｎｉ ｎ ｕ ｔｏ ｅ ｉｉａ ｉ ｎ ｏ ｐｉｈｉ ｓ ｃ ｆｅ ｒ ｔ ｉ ｅ ｒ ｍ ｏ ｎｇ ａ ｄ ｆ ｎｃ ｉ ｎ ｖ ｒ ｆｃ ｔｏ ｆ ｅ ｔ ０ ｐｅ ｉｉ ｒ ｐ ｏ ｅ ｎ ｇ ｎｅ ｆ ｏ Ｃｈｉ ｅ ｅ ｃ ｂ ｇ ｎ ｓ ａ ｂａ ｅ．Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｏ ｒ ａ ｆ Ｚｈ ｊ ｎ ｉｅ ｓｔ （ ｒ ．＆ Ｌｉ ｃ． ，２ １ ， ８ ５ ５ ５５ １ ｅｉ ｇ Ｕｎｖ ｒ ｉ Ａｇ ｉ ａ ｙ ｃ ｆ Ｓ ｉ） ０ ２ ３ （ ）：３ — ４ ｅ
摘 要 为 阐 明上 皮硫 特 异 蛋 白 （ ｐｔ ｉｓ ｅ ． ｅ ｒ ｔｉ ） 能 ， 白 菜 上 皮 硫 特 异 蛋 白 基 因 （ ｃ Ｓ 进 行 克 隆 并 ｅ ｉ ｏ ｐ ｃｆ ｒｐ ｏｅｎ 功 ｈ ｉ 对 Ｂ Ｅ Ｐ） 对 其 功 能 进 行 初 步 验 证 ． 果 表 明 ： ｃ Ｓ 全 长 ｃ Ａ 编 码 含 ３ ３个 氨 基 酸 的 蛋 白 质 ， ｅ Ｓ 与 拟 南 芥 Ｅ Ｐ 结 ＢＥ Ｐ ＤＮ ４ ＢＥ Ｐ Ｓ
植物乙烯信号转导途径的克隆及功能分析
植物乙烯信号转导途径的克隆及功能分析植物乙烯信号转导途径是植物对外界环境变化的响应方式之一，它控制着植物生长发育、胁迫应答等多个方面。
本文将介绍植物乙烯信号转导途径的克隆及功能分析相关研究成果。
一、乙烯信号转导途径主要成分的克隆1.乙烯受体乙烯信号分子最初被植物细胞膜上的乙烯受体（ETR）识别，从而开启了后续的信号转导。
早期研究已经克隆了乙烯受体的基因，在许多植物物种中都发现了乙烯受体家族的存在。
如在拟南芥中，五个亚型的乙烯受体ETR1、ETR2、ERS1、ERS2和EIN4已经被确认。
其中ETR1和ERS1是较为重要的乙烯受体，关键的点突变会导致它们的信号传导紊乱。
2.乙烯感应因子乙烯感应因子（EIN）是乙烯信号转导途径中重要的转录因子。
在拟南芥中，EIN3被认为是乙烯感应因子的关键调控者，能够介导乙烯诱导的基因转录，并通过调整细胞质液泡和核糖体的流通促进植物的生长。
此外，EIN2、EIN5、EIN6等基因也被证实和乙烯感应有关。
3.其他信号分子乙烯信号转导途径中还涉及其他一些信号分子，包括Coi1（jasmonic acid signaling）、BZR1（brassinosteroid signaling）、ABI4（ABA signaling）等。
需要注意的是，这些信号分子在不同的植物物种中可能产生不同的作用，因此需要分别进行研究。
二、乙烯信号转导途径的功能分析通过对乙烯信号转导途径相关基因的克隆和功能分析，科学家们为我们揭示了许多关于该途径的生物学特性。
1.植物生长和发育研究表明，在乙烯信号转导途径中，ETR和EIN3是发挥调控生长发育功能的重要基因。
当乙烯信号分子结合ETR后，会使其激活。
接下来，活化的ETR会通过EIN2介导EIN3的下游信号通路，以实现对植物短期和长期生长发育的调控。
一些实验表明，通过改变ETR和EIN3的表达水平，可以使植物在形态结构、根系分支、叶片大小等多个方面产生明显差异。
植物转录因子与调控基因表达的作用
植物转录因子与调控基因表达的作用植物是一个复杂的生物体系，其生长发育、代谢反应、胁迫响应等过程都需要基因表达的调控。
目前研究发现，植物转录因子（Plant Transcription factors，PTFs）是调控基因表达的重要调节因子之一。
本文将就植物转录因子的分类、功能和应用进行阐述。
一、植物转录因子的分类植物转录因子是可以结合到基因特定启动子上，参与转录调控的分子。
植物转录因子在基因调控中起到了重要作用，目前已经发现了超过2000种不同类型的植物转录因子。
这些植物转录因子可以根据其结构、启动子结合位点、调控能力等进行分类，其中一些常见的分类包括：1. 基于DNA结合域的分类。
DNA结合域是植物转录因子特征之一，一般可以分为17类，例如HLH、AP2/EREBP、MYB等；2. 基于激活和抑制功能的分类。
这种分类方法通常根据植物转录因子调控基因表达的效应进行分类，包括激活型和抑制型；3. 基于交互伴侣的分类。
植物中的转录因子通过不同的交互伴侣，调控不同的信号通路。
这种分类方法是通过分析植物转录因子与其他蛋白质的相互作用来进行分类，例如BES1和BZR1等。
二、植物转录因子在基因表达中的作用植物转录因子是可以结合到基因启动子区域上的DNA结合蛋白，在基因调控过程中，其主要功能是促进或抑制转录机器的启动。
很多植物转录因子调控的基因存在于复杂的基因调控网络中，它们之间能够产生各种不同的交互作用，从而又能进一步调节基因表达。
下面将介绍一下植物转录因子在调控基因表达中的作用：1. 促进或抑制甲基化。
调控基因表达的甲基化是一个非常关键的环节。
植物中的一些转录因子被证明具有促进或抑制甲基化的功能，例如H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3、H3K9me2和H3K27ac等，这些甲基化可以直接影响基因表达，从而影响植物的生长与发育。
2. 参与胁迫逆境的响应。
在植物的生长发育过程中，常常会面临各种胁迫与逆境的挑战，例如缺水、高温、低温、盐碱等。
两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):１~９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.００１收稿日期:２０２２－１０－１７基金项目:国家自然科学基金项目(３２２０２４６５)ꎻ广东省自然科学基金项目(２０１９Ａ１５１５０１１６８０)ꎻ韶关市科技攻关项目(２００８１０２２４５３７５３５)ꎻ韶关学院博士科研启动项目(９９０００６１３)作者简介:朱云娜(１９８２ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事蔬菜生理与分子生物学研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｕｙｎ３２６＠１２６.ｃｏｍ通信作者:刘建国(１９８１ )ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ助理实验师ꎬ主要从事园艺生理生态研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｊｇｌｉｕ＠ｓｇｕ.ｅｄｕ.ｃｎ两个菜心ＣＢＬ基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析朱云娜１ꎬ２ꎬ符质２ꎬ冯慧敏１ꎬ２ꎬ王斌１ꎬ２ꎬ沈雪晴２ꎬ汤婉君２ꎬ刘建国１ꎬ２(１.广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室ꎬ广东韶关㊀５１２００５ꎻ２.韶关学院英东生物与农业学院ꎬ广东韶关㊀５１２００５)㊀㊀摘要:本研究以 油绿５０１ 菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)为材料ꎬ采用同源克隆方法对其ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因进行克隆ꎬ运用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ软件对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析ꎬ并利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析二者在菜心组织中及不同氮素形态条件下的表达模式ꎮ结果表明:菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ｃＤＮＡ全长均为６４２ｂｐꎬ编码２１３个氨基酸ꎬ分别命名为ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９ꎬ具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码的氨基酸序列与拟南芥(Ａｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)㊁大白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ)等物种的同源性均达９５％以上ꎻ二者分别与大白菜的ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９遗传距离最近ꎬ并与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９共同聚类为一支ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心各组织器官中均有表达ꎬ前者在菜心叶片中表达水平较高ꎬ后者在菜心荚果等组织中表达水平较高ꎻ两者表达受氮素形态及水平影响ꎬ前者在低浓度ＮＯ－３或ＮＨ＋４处理后上调表达ꎬ后者表达随ＮＨ＋４浓度增加而上调表达ꎮ该研究结果可为进一步研究菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９在氮素吸收利用过程中的功能及其调控机制提供一定理论基础ꎮ关键词:菜心ꎻ氮素形态ꎻ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎻ基因克隆ꎻ生物信息学分析ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ６３４.９:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－０００１－０９ＣｌｏｎｉｎｇꎬＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴｗｏＣＢＬＧｅｎｅｓｉｎＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅＣａｂｂａｇｅＺｈｕＹｕｎｎａ１ꎬ２ꎬＦｕＺｈｉ２ꎬＦｅｎｇＨｕｉｍｉｎ１ꎬ２ꎬＷａｎｇＢｉｎ１ꎬ２ꎬＳｈｅｎＸｕｅｑｉｎｇ２ꎬＴａｎｇＷａｎｊｕｎ２ꎬＬｉｕＪｉａｎｇｕｏ１ꎬ２(１.ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＦｏｏｄａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＨｅｎｒｙＦｏｋＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＳｈａｏｇｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃｌｏｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)ｖａｒｉｅｔｙ Ｙｏｕｌü５０１ ꎬｗｈｏｓｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮａｎｄＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅ.ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｉｎｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｂｏｔｈ６４２ｂｐꎬｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄ２１３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄｎａｍｅｄＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＢｏｔｈｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄＥＦ￣ｈａｎｄｄｏｍａｉｎ(ＥＦｈ)ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒＣＢＬｐｒｏｔｅｉｎｔｏｂｉｎｄＣａ２＋.ＨｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ９５％.Ａｃ￣ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＢｒＣＢＬ１ａｎｄＢｒＣＢＬ９ｏｆＢ.ｒａｐａꎬａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓａｍｅｂｒａｎｃｈｗｉｔｈＡｔＣＢＬ１ａｎｄＡｔＣＢＬ９ｏｆＡ.ｔｈａｌｉａｎａꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎬＢｃＣＢＬ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｌｅａｖｅｓａｎｄＢｃＣＢＬ９ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｐｏｄｓ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅａｆｆｅｃｔ￣ｅｄｂｙｔｈｅｆｏｒｍｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ.ＢｃＣＢＬ１ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＯ－３ｏｒＮＨ＋４ꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＣＢＬ９ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆＮＨ＋４.Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｏｆｆｌｏｗ￣ｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｕｐｔａｋｅａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎻＮｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓꎻＣａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀钙作为第二信使在植物信号转导中具有重要调控作用[１ꎬ２]ꎮ钙调蛋白(ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎꎬＣａＭ)㊁类钙调蛋白(ＣａＭ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＭＬ)㊁类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白(ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＢＬ)和钙依赖型蛋白激酶(Ｃａ２＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅꎬＣＤ￣ＰＫ)是植物体内常见的钙感受器种类[３ꎬ４]ꎮ除ＣＤＰＫ中含有蛋白激酶结构域外ꎬ其他３个钙感受器都不含激酶结构域ꎬ必须与靶蛋白结合形成复合体才能传递钙信号[４ꎬ５]ꎮＣＢＬ起源于绿藻和苔藓ꎬ现广泛存在于被子植物和裸子植物中ꎬ是一种古老的钙感受器[６]ꎬ具有典型的结合Ｃａ２＋结构域 ＥＦ手臂(ＥＦ￣ｈａｎｄ)[１]ꎮ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白激酶(ＣＢＬｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓꎬＣＩＰＫ)是ＣＢＬ特异结合的蛋白激酶ꎬ通过形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应[１ꎬ４ꎬ５]ꎮ不同植物ＣＢＬ成员数量不同ꎬ拟南芥[１ꎬ７]㊁烟草[８]㊁黄瓜[９]㊁大白菜[１０]中分别有１０㊁２０㊁６㊁１３个ＣＢＬｓ成员ꎮ植物ＣＢＬｓ参与种子发芽㊁花粉管萌发等生长发育过程[１ꎬ２]ꎬ也参与响应高盐㊁低温㊁干旱等逆境胁迫[１ꎬ４ꎬ１１－１３]ꎮＣＩＰＫ２３在调控矿质营养转运蛋白方面具有重要作用[１ꎬ４ꎬ１１－１４]ꎮ低钾胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１/ＡｔＣＢＬ９可将ＡｔＣＩＰＫ２３定位到质膜ꎬ使其通过磷酸化激活钾离子通道蛋白(ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ꎬＡＫＴ１)ꎬ从而增加拟南芥细胞对Ｋ＋的吸收[１５]ꎮ近年来的研究表明ꎬ水稻早期氮响应因子在蛋白质磷酸化等方面富集[１６]ꎬ而氮转运蛋白活性也依赖于外界氮信号所触发的磷酸化[１７]ꎬ因此ꎬ蛋白磷酸化在氮信号传导㊁氮代谢方面发挥重要作用ꎮ如:ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体通过调控氮转运蛋白磷酸化水平调控拟南芥氮信号通路[１８－２０]ꎻＡｔＣＢＬ１/９－ＡｔＣＩＰＫ２３通过磷酸化修饰ꎬ调控拟南芥硝态氮转运蛋白(ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１.１ꎬＮＲＴ１.１)亲和性的转变ꎬ以适应不同浓度硝酸盐(ＮＯ－３)条件下对ＮＯ－３的吸收[１８]ꎻ在高铵(ＮＨ＋４)胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１－ＡｔＣＩＰＫ２３可调控铵态氮转运蛋白(ａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒꎬＡＭＴ)ＡＭＴ１.１和ＡＭＴ１.２的磷酸化ꎬ使其失去活性ꎬ避免吸收过量ＮＨ＋４[１９ꎬ２１]ꎮ我们最近研究发现ꎬ菜心铵转运蛋白ＢｃＡＭＴ１ｓ可与ＣＩＰＫ２３互作[２２]ꎬ菜心ＣＩＰＫ２３表达受氮素水平和氮素形态的影响(待发表)ꎮ不同ＣＢＬｓ可能参与同一种非生物胁迫ꎬ相同ＣＢＬ可能参与不同非生物胁迫响应[１]ꎮ为此ꎬ本文选择可与ＣＩＰＫ２３互作的ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９为研究对象ꎬ采用同源克隆法获得菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９的全长序列ꎬ并分析其生物学特性㊁组织表达特性以及对不同氮素形态的响应ꎬ以期为提高菜心氮素吸收利用的作用机理研究提供一定的理论支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料及样品处理供试菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)品种为 油绿５０１ (由广州市农业科学研究院选育)ꎬ于２０２１年３ ５月在广东省韶关市韶关学院英东生物与农业学院生态园玻璃温室内培养ꎮ将菜心种子用７.５％的ＮａＣｌＯ消毒１０ｍｉｎꎬ用无菌水清洗４~５次ꎬ然后播种于海绵块上进行育苗ꎬ待幼苗长至三叶一心时移植到改良霍格兰营养液中进行培养ꎮ之后根据不同２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀试验要求进行处理㊁取样ꎮ１.１.１㊀基因表达组织特异性分析的样品采集㊀菜心幼苗移栽后生长３０~４０ｄꎬ待角果结荚后ꎬ分别取根㊁茎㊁叶㊁花㊁叶柄㊁荚果㊁花蕾㊁薹茎等组织样品ꎬ用于基因表达的组织特异性分析ꎮ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后保存在－８０ħ冰箱中备用ꎮ１.１.２㊀不同水平氮素处理试验的样品处理㊀菜心移苗后在１个剂量的改良霍格兰营养液中培养４ｄꎬ取出用蒸馏水冲洗根部ꎬ然后转移到缺氮营养液中再培养４ｄꎬ将菜心苗分苗移栽到１㊁４㊁８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ４Ｃｌ/ＮａＮＯ３营养液中处理２ｈꎬ分别对叶片和根系进行取样ꎬ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后置于－８０ħ冰箱保存备用ꎮ１.２㊀总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成采用Ｅａｓｔｅｐ®Ｓｕｐｅｒ植物总ＲＮＡ提取试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]提取总ＲＮＡꎬ采用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]反转录合成ｃＤＮＡꎮ１.３㊀菜心ＣＢＬｓ基因克隆在ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)查找拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９的基因序列ꎬ然后在大白菜(Ｂｒａｓ￣ｓｉｃａｒａｐａ)基因组进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ得到与其同源性最高的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)基因序列ꎮ菜心是大白菜的一个变种ꎬ亲缘关系较近ꎬ因此根据大白菜ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９基因序列设计同源引物用于克隆菜心相应的基因ꎮ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物ꎬ引物序列见表１ꎮ设置２０μＬＰＣＲ反应体系:ＰｒｉｍｅｒｓｔａｒＭａｘｐｒｉｍｅｒ１０μＬꎬｃＤＮＡ模板链１μＬꎬ上下游引物各１μＬꎬ加ｄｄＨ２Ｏ补充至２０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ预变性５ｍｉｎꎻ９８ħ２０ｓꎬ５８ħ２０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ延伸１ｍｉｎꎮ回收扩增产物ꎬ连接到ｐＭＤ２０－Ｔ载体并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ将经ＰＣＲ鉴定的阳性克隆送广州擎科生物技术有限公司测序ꎮ１.４㊀生物信息学分析利用表２所列软件对菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因编码蛋白及其氨基酸序列进行分析ꎮ㊀㊀表１㊀所用引物及其序列引物序列(５ᶄ－３ᶄ)用途ＣＢＬ１Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＲ:ＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＢＬ９Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＣＲ:ＴＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣ基因克隆ｑ－ＣＢＬ１Ｆ:ＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＧＲ:ＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴｑ－ＣＢＬ９Ｆ:ＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＡＲ:ＴＧＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＧＴ荧光定量ＰＣＲＧＡＤＰＨＦ:ＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＧＧＲ:ＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＮＧＡＧＮＴＮＧＡＧＡＣＲ:ＣＴＧＴＴＧＧＡＡＮＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡ荧光定量ＰＣＲ内参㊀㊀表２㊀所用软件及其网址软件网址用途ＰｒｏｔＰａｒａｍｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/蛋白质理化特性分析ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａ/蛋白疏水性分析Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ－２/ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０ｈｔｔｐ://ｌｉｎｕｘ１.ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ.ｃｏｍ/ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ?ｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｌｏｃ＆ｔｏｐｉｃ＝ｐｒｏｔｃｏｍｐｐｌ蛋白亚细胞定位ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＴＭＨＭＭ－２.０蛋白质跨膜结构分析ＮｅｔＰｈｏｓ３.１ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＮｅｔＰｈｏｓ/磷酸化位点分析ＳｉｇｎａｌＰ５.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＳｉｇｎａｌＰ－５.０蛋白质信号肽预测Ｅｘｐａｓｙｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质二级结构分析ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质三维结构预测ＳＭＡＲＴｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/保守结构域分析ＳＴＲＩＮＧｈｔｔｐｓ://ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ.ｏｒｇ/蛋白互作分析１.５㊀基因表达量的ｑＲＴ－ＰＣＲ分析按照１.２中的方法提取菜心样品的ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡꎬｃＤＮＡ样品用ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ稀释５倍后作为模板ꎬ利用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ®ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ进行荧光定量ＰＣＲ分析ꎮ扩增体系:２ˑＳＹＢＲＧｒｅｅｎＴａｑＴＭ１０μＬꎬ１０μｍｏｌ/Ｌ上下游引物各０.４μＬꎬｃＤＮＡ模板２μＬꎬ用ＲＮａｓｅ￣ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ补充到２０.０μＬꎮ扩增程序:９５ħ预变性３ｍｉｎꎬ９５ħ１０ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ循环４０次ꎮ以ＧＡＤＰＨ和Ａｃｔｉｎ２为内参基因ꎬ用２－ΔΔＣｔ计算基因相对表达量[２３]ꎮ１.６㊀数据统计分析与作图用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０整理数据ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０进行统计分析ꎬ用Ｄｕｎｃａｎ ｓ法进行显著性分析ꎬ用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１.０作图ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀菜心ＣＢＬ１、ＣＢＬ９基因的克隆以菜心叶片ｃＤＮＡ为模板ꎬ用ＣＢＬ１－Ｆ㊁ＣＢＬ１－３㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析Ｒ和ＣＢＬ９－Ｆ㊁ＣＢＬ９－Ｒ引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ均获得约６５０ｂｐ的基因片段(图１)ꎮ经测序ꎬ克隆得到的基因片段长度均为６４２ｂｐꎮ通过ＢＬＡＳＴ在线比对ꎬ菜心ＣＢＬ１基因片段与拟南芥的ＡｔＣＢＬ１(ＮＭ＿００１３４１２３８.１)㊁甘蓝型油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)的ＢｎＣＢＬ１(ＸＭ＿０１３８８１８４６.３)㊁大白菜的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)的核苷酸序列同源性分别为９１.１２％㊁９８.２９％㊁９８.４４％ꎻ而菜心ＣＢＬ９基因片段与ＡｔＣＢＬ９(ＮＭ＿１２４０８１.４)㊁ＢｎＣＢＬ９(ＸＭ＿０１３８４０９１２.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)的核苷酸序列同源性分别为９２.２１％㊁９９.６９％㊁９９.６９％ꎮ初步表明所克隆的两个基因片段分别为菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因序列ꎮ将这两个基因分别命名为ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＢｃＣＢＬ１基因扩增条带ꎻ２:ＢｃＣＢＬ９基因扩增条带ꎮ图１㊀菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ＰＣＲ扩增图谱２.２㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的氨基酸序列分析利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ和ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅ对Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白序列进行分析ꎬ结果显示ꎬＢｃＣＢＬ１编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.６０ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１１０９Ｈ１７２５Ｎ２７７Ｏ３３６Ｓ９ꎬ理论等电点(ｐＩ)为４.６４ꎬ平均疏水率为－０.１７３ꎬ脂肪酸系数为８９.２０ꎬ不稳定系数为３６.３５ꎮＢｃＣＢＬ９编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.４１ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１０９７Ｈ１７０３Ｎ２７５Ｏ３３８Ｓ８ꎬｐＩ为４.５８ꎬ平均疏水率为－０.１８５ꎬ脂肪酸系数为８８.３１ꎬ不稳定系数为３４.６９ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均为可溶性亲水蛋白ꎮ通过ＳｉｇｎａｌＰ５.０预测分析发现二者均无信号肽序列ꎬ为非分泌型蛋白ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均有多个丝氨酸磷酸位点(ｓｅｒ)和苏氨酸磷酸位点(Ｔｈｒ)ꎮ利用Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０和ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０预测ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９亚细胞定位ꎬ均定位于细胞膜上ꎻＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０分析结果表明二者均无跨膜结构ꎮ２.３㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９的二㊁三级结构分析运用Ｅｘｐａｓｙ的ＳＯＰＭＡ对ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白的二级结构进行预测分析ꎬ结果(图２)显示ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白含有α－螺旋(ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ)５０.７０％㊁β－折叠延伸链(ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ)１１.７４％㊁β－转角(ｂｅ￣ｔａｔｕｒｎ)５.１６％㊁无规则卷曲(ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ)３２.３９％ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白的α－螺旋㊁β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲分别为５２.１１％㊁７.９８％㊁６.５７％㊁３３.３３％ꎮ可见ꎬ两者的主要组成部分均为α－螺旋ꎬβ－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲则散布于蛋白结构中ꎮ三级结构预测结果与该结果一致ꎮ另外ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白三级结构为单体结构ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构为二聚体结构(图３)ꎮ２.４㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９氨基酸序列同源性比对及系统进化分析将ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与ＡｔＣＢＬ１(ＮＰ＿５６７５３３.１)㊁ＡｔＣＢＬ９(ＮＰ＿１９９５２１.１)㊁ＢｒＣＢＬ１(ＸＰ＿００９１３６８５５.１)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＰ＿００９１２８９３８.１)进行氨基酸序列多重比对分析ꎬ结果(图４)显示ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与两个物种ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸相似性介于９５.３１％~１００％ꎬ其中ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１相似性高达１００％ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９相似性为９９.５３％ꎮ蓝色代表α－螺旋ꎻ绿色代表β－转角ꎻ紫色代表β－折叠延伸链ꎻ红色代表无规则卷曲ꎮ图２㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白二级结构预测４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构预测图４㊀菜心㊁拟南芥㊁大白菜ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９氨基酸序列多重比对结果㊀㊀利用ＳＭＡＲＴ在线工具对两个菜心ＣＢＬ基因编码氨基酸进行保守结构域分析ꎬ结果(图５)表明ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎬ保守结构域均为３个且位置相同ꎬ位于第７１~９９㊁１０８~１３６㊁１５２~１８０位氨基酸ꎬＦＡＮＲＩＦＤＭＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ１)和ＦＡＮＲＩＦＤＬＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ９)ꎬＫＩＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(ＢｃＣＢＬ１)和ＫＴＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(Ｂｃ￣ＣＢＬ９)ꎬＩＬＤＫＴＦＥＤＡＤＶＮＱＤＧＫＩＤＫＬＥＷＳＤＦＶＮＫＮ(ＢｃＣＢＬ１)和ＩＬＤＱＴＦＥＤＡＤＶＤＲＤＧＫＩＤＫＴＥＷＳＤ￣ＦＶＩＫＮ(ＢｃＣＢＬ９)ꎮ图５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９保守结构域分析进化树分析结果(图６)表明ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１图６㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与拟南芥㊁大白菜ＣＢＬｓ的进化树分析５㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析亲缘关系最近ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９亲缘关系最近ꎬ其次分别为ＡｔＣＢＬ１和ＡｔＣＢＬ９ꎬ且菜心㊁大白菜㊁拟南芥的ＣＢＬ１与ＣＢＬ９同聚类在一个分支ꎬ而与拟南芥㊁大白菜的其他ＣＢＬ成员相距较远ꎮ进一步表明本研究分离得到的２个菜心ＣＢＬ基因属于植物ＣＢＬｓ基因家族成员ꎬ编码类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎮ２.５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９在菜心不同器官中的表达分析由图７可知ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎮＢｃＣＢＬ１在菜心叶中表达量最高ꎬ显著高于其他器官ꎬ其次为根㊁茎ꎻ在叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中表达量相对较低ꎬ且器官间无显著差异ꎮＢｃＣＢＬ９在菜心荚果中表达量最高ꎬ其次为薹茎ꎬ两者间差异显著且均显著高于其他器官ꎻ在叶㊁叶柄㊁花㊁根㊁茎中表达量相对较低ꎬ在花蕾中的表达量最低ꎬ显著低于其他器官ꎬ仅为荚果中表达量的３.３３％ꎮ两个基因均以菜心根系中ＢｃＣＢＬ１的相对表达量为１进行比较分析ꎮ不同小写字母表示在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎬ下同ꎮ图７㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)在菜心不同器官中的表达分析２.６㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９对不同氮素形态的响应由图８可知ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９表达量受氮素形态及其水平影响ꎬ二者表现出不同的表达模式ꎮＢｃＣＢＬ１在低浓度氮条件表达量较高ꎬ表达量有随氮浓度增加而明显下降的趋势ꎻ在８ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下ꎬ菜心根和叶中的ＢｃＣＢＬ１表达量也较高ꎬ为１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下的５.９２％~４１.４１％ꎮＢｃＣＢＬ１表达还受不同氮素形态影响ꎬ在相同浓度条件下ꎬＮＨ＋４处理的菜心根中ＢｃＣＢＬ１表达量最高ꎬＮＯ－３处理的次之ꎬＮＨ４ＮＯ３处理的最低(图８Ａ)ꎻ在菜心叶中ꎬＢｃＣＢＬ１表达也呈现出与根中类似的变化规律(图８Ｂ)ꎮ由图８Ｃ看出ꎬ在菜心根中ꎬＢｃＣＢＬ９表达量随着ＮＨ＋４浓度增加显著增加ꎬ８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４处理下最高ꎬ分别是中㊁低浓度ＮＨ＋４处理下的１.９６倍和４８.１６倍ꎻ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬ随其浓度增加ꎬＢｃＣＢＬ９表达量均呈现出先下降后上升的趋势ꎬ且不同浓度处理间差异显著ꎬ但表达量最高值分别出现在低浓度和高浓度处理时ꎮ在菜心叶中(图８Ｄ)ꎬＢｃＣＢＬ９表达水平随ＮＯ－３浓度增加而降低ꎬ中㊁高浓度处理间表达量差异不显著ꎬ但显著低于低浓度处理ꎻ在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬＢｃ￣ＣＢＬ９表达水平随浓度的变化趋势与根系中相似ꎬ但变化幅度略小ꎬ其中ꎬ中浓度与高浓度ＮＨ＋４处理间㊁低浓度与高浓度ＮＨ４ＮＯ３处理间差异不显著ꎮ此外ꎬ与ＢｃＣＢＬ１相比ꎬ无论在菜心根还是叶中ꎬＢｃＣＢＬ９均保持较高的表达水平ꎬ暗示两基因可能在氮素吸收利用方面发挥着不同作用ꎮ２.７㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白互作关系在ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库中输入ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白序列ꎬ选择 拟南芥 为所属物种ꎬ利用拟南芥蛋白构建互作关系网络ꎬ据此推测Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的互作蛋白ꎮ由图９推测可知ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３㊁ＳＯＳ２㊁ＳＩＰ３)㊁钾离子通道蛋白ＡＫＴ１具有互作关系ꎻ而ＢｃＣＢＬ９蛋白也可与ＡＫＴ１和ＣＩＰＫ家族蛋白互作ꎬ但其互作网络中未包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬ菜心ＢｃＣＢＬ９还可与免疫亲和蛋白(ＦＫＢＰ１２)和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮ６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀横坐标的Ｎ㊁Ａ㊁ＮＡ分别代表ＮＯ－３㊁ＮＨ＋４㊁ＮＨ４ＮＯ３ꎬ１㊁４㊁８分别指３种浓度处理ꎬ单位均为ｍｍｏｌ/Ｌꎮ两个基因均以１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３处理的菜心根系ＢｃＣＢＬ１表达量为１进行比较分析ꎮ图８㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ㊁Ｂ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｃ㊁Ｄ)对不同氮素形态的响应图９㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)蛋白的互作网络３㊀讨论与结论本研究从菜心中克隆到两个完整的ＣＢＬ基因 ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎬ开放阅读框均为６４２ｂｐꎬ均编码２１３个氨基酸残基ꎻＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域ꎻ与大白菜㊁拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸序列同源性均在９５％以上ꎬ聚类于同一进化分支ꎬ但与其他ＣＢＬ成员的遗传距离较远ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白均为稳定性蛋白ꎬ具有较强的亲水性ꎬ定位于细胞质膜上ꎬ无跨膜结构ꎬ无信号肽ꎬ与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９[２４]和唐古特白刺Ｎｔ￣ＣＢＬ的定位结果一致[１１]ꎮＣＢＬ定位于质膜上表明其可能通过结合膜蛋白在细胞中发挥作用[１１]ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白结构的主要组成部分均为α－螺旋ꎬ散布β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则７㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析卷曲ꎻ然而ꎬＢｃＣＢＬ１为单体结构ꎬＢｃＣＢＬ９蛋白为二聚体结构ꎬ暗示两者可能发挥着不同的生物学功能ꎮ基因在不同组织中的表达特性可能暗示其在相应表达部位的生物学功能[２５]ꎮ在已研究的植物中ꎬ多数ＣＢＬ在各个组织或器官中具有不同程度表达ꎬ在某些组织中具有表达优势[８]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎬ其中ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１在叶中的表达量远高于在其他组织中ꎬ而ＢｃＣＢＬ９在荚果中的表达量显著高于在其他组织中ꎬ暗示两基因可能分别主要在菜心叶和荚果生长发育过程中发挥作用ꎮ研究报道ꎬＣＢＬ１/９可与ＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与拟南芥氮信号通路调控[１８ꎬ１９]ꎬ并可响应低温㊁高盐㊁干旱㊁低钾等多种逆境胁迫ꎬ在植物生长发育过程和非生物胁迫中具有重要作用[１３ꎬ２０]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９确实可响应外界氮素变化ꎬ二者的表达水平不仅受不同氮素形态影响ꎬ也受氮素水平影响ꎬ但二者呈现出不同的变化趋势ꎮ其中ꎬＢｃＣＢＬ１在低浓度(１ｍｍｏｌ/Ｌ)单一氮源(ＮＯ－３或ＮＨ＋４)条件上调表达ꎬ而在中(４ｍｍｏｌ/Ｌ)㊁高浓度(８ｍｍｏｌ/Ｌ)或混合氮源(ＮＨ４ＮＯ３)条件下调表达ꎬ甚至不表达ꎻＢｃＣＢＬ９在低浓度ＮＨ＋４条件下表达量低ꎬ在中㊁高浓度ＮＨ＋４条件下表达量高ꎬ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理时ꎬＢｃＣＢＬ９在低/高氮浓度下表达水平较高ꎬ在中等浓度下表达量较低ꎮ这与ＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导上调表达而在高浓度ＮＯ－３时下调表达[１８]的结论一致ꎮＳｔｒａｕｂ[２４]报道ꎬ拟南芥ＡｔＣＢＬ１表达依赖于ＮＨ＋４ꎬ缺氮后恢复供２ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４可诱导其表达ꎬ供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ时ꎬＡｔＣＢＬ１表达量达到峰值ꎬ随后开始下降ꎻ而ＡｔＣＢＬ９表达量在供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ后才开始增加ꎬ随后基本无明显变化ꎮ本研究主要对供不同浓度不同形态氮素２ｈ后ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在菜心中的表达情况进行分析ꎬ并未比较不同供氮时间对二者表达量的影响ꎬ可在今后研究中增加该项目ꎮ通过ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库ꎬ利用拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９蛋白构建互作蛋白网络ꎬ据此推测菜心的ＢｃＣＢＬ１与ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３等ＣＩＰＫ家族成员及钾离子通道蛋白ＡＫＴ１互作ꎻ而ＢｃＣＢＬ９虽可与ＡＫＴ１㊁ＣＩＰＫｓ互作ꎬ但ＣＩＰＫ成员不包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬＢｃＣＢＬ９还可与ＦＫＢＰ１２和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮＳＴＲＩＮＧ数据库对ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白注释为含有蛋白磷酸酶２Ｃ和环核苷酸结合/激酶结构域蛋白ꎬ参与调控蛋白质磷酸化ꎮＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导表达ꎬ促进其与ＣＩＰＫ２３形成复合体以调控ＡｔＮＲＴ１.１磷酸化水平ꎬ从而促进ＮＯ－３运输[１８]ꎮ在拟南芥中ꎬＡｔＣＢＬ１与ＡｔＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体ꎬ参与调控ＡｔＡＭＴ１.１和ＡｔＡＭＴ１.２蛋白磷酸化水平ꎬ从而调控拟南芥根系对ＮＨ＋４的吸收ꎬ而ＡｔＣＢＬ９并未参与调控[１９ꎬ２１ꎬ２４]ꎮ本研究发现菜心ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９表达均受不同氮素形态和氮素水平影响ꎬ二者在不同氮素形态下如何调控氮素吸收利用ꎬ是否存在功能冗余现象ꎬ仍需进一步研究ꎮ综上ꎬ本研究分离得到的ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因属于菜心ＣＢＬ基因家族成员ꎬ具有组织表达特异性ꎬ受氮素不同形态不同水平影响ꎬ但两者表达模式不同ꎬ可能参与调控不同氮素条件下的氮吸收与利用过程ꎬ具体作用机制还需进一步探究ꎮ在今后研究中ꎬ可将氮素供应时间进一步细化ꎬ观察ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在不同供氮时间下的表达模式ꎬ再利用ＶＩＧＳ对基因进行沉默ꎬ验证其功能ꎮ本研究结果可对进一步探究菜心氮素吸收利用分子机制提供一定的理论依据ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张传鹏ꎬ戴绍军ꎬ魏建华ꎬ等.ＣＢＬ家族在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用[Ｊ].现代农业科技ꎬ２０１３ꎬ５:２３０－２３１ꎬ２３４.[２]㊀ＭäｈｓＡꎬＳｔｅｉｎｈｏｒｓｔＬꎬＨａｎＪＰꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅＣａ２＋ｓｅｎｓｏｒｓＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｐｏｌｌｅｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔꎬ２０１３ꎬ６(４):１１４９－１１６２.[３]㊀曾后清ꎬ张夏俊ꎬ张亚仙ꎬ等.植物类钙调素生理功能的研究进展[Ｊ].中国科学:生命科学ꎬ２０１６ꎬ４６(６):７０５－７１５. [４]㊀马瑞ꎬ李世贵ꎬ刘维刚ꎬ等.植物ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统的功能及其响应非生物胁迫作用机制研究进展[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０２１ꎬ５７(３):５２１－５３０.[５]㊀王海波ꎬ李芙蓉ꎬ杨金翠ꎬ等.ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统参与小桐子抗冷性形成的生物信息学分析[Ｊ].广西植物ꎬ２０２２ꎬ４２(６):９９６－１００７.[６]㊀ＷｅｉｎｌＳꎬＫｕｄｌａＪ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫＣａ２＋￣ｄｅｃｏｄｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔ￣８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ｗｏｒｋ:ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２００９ꎬ１８４(３):５１７－５２８.[７]㊀ＫｏｌｕｋｉｓａｏｇｌｕＵꎬＷｅｉｎｌＳꎬＢｌａｚｅｖｉｃＤꎬｅｔａｌ.Ｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ:ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐ￣ｓｉｓａｎｄｒｉｃｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２００４ꎬ１３４(１):４３－５８.[８]㊀曾文艺ꎬ周思如ꎬ左同鸿ꎬ等.普通烟草ＣＢＬ基因家族全基因组鉴定与分析[Ｊ/ＯＬ].分子植物育种ꎬ２０２２－０１－１０.ＤＯＩ:２０２２.４６.１０６８.Ｓ.２０２２０１１０.１３１７.０１０.[９]㊀曹齐卫ꎬ刘明毓ꎬ陈伟ꎬ等.黄瓜ＣＢＬ基因的鉴定和特征分析[Ｊ].核农学报ꎬ２０１６ꎬ３０(１１):２１２７－２１３２. [１０]李利斌ꎬ王殿峰ꎬ刘立锋ꎬ等.大白菜ＣＢＬ家族基因的鉴定和遗传进化分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２００９ꎬ５:４－７ꎬ１１. [１１]黎梦娟ꎬ朱礼明ꎬ霍俊男ꎬ等.唐古特白刺ＮｔＣＢＬ１㊁ＮｔＣＢＬ２基因克隆及表达分析[Ｊ].南京林业大学学报(自然科学版)ꎬ２０２１ꎬ４５(３):９３－９９.[１２]张俊文ꎬ魏建华ꎬ王宏芝ꎬ等.ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统在植物应答逆境胁迫中的作用与机制[Ｊ].自然科学进展ꎬ２００８ꎬ１８(８):８４７－８５６.[１３]ＭａＸꎬＬｉＱＨꎬＹｕＹＮꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｐａｔｈｗａｙｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｒｅｓｓｓｉｇｎａｌｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏ￣ｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ２１(１６):５６６８.[１４]ＲóｄｅｎａｓＲꎬＶｅｒｔＧ.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｂｙＣＩＰＫ２３: Ｏｎｅｋｉｎａｓｅｔｏｒｕｌｅｔｈｅｍａｌｌ [Ｊ].ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ６２(４):５５３－５６３.[１５]ＢｅｈｅｒａＳꎬＬｏｎｇＹꎬＳｃｈｍｉｔｚ￣ＴｈｏｍＩꎬｅｔａｌ.ＴｗｏｓｐａｔｉａｌｌｙａｎｄｔｅｍｐｏｒａｌｌｙｄｉｓｔｉｎｃｔＣａ２＋ｓｉｇｎａｌｓｃｏｎｖｅｙＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｓｔｏＫ＋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１７ꎬ２１３(２):７３９－７５０.[１６]ＹａｎｇＨＣꎬＫａｎＣＣꎬＨｕｎｇＴＨꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｅａｒｌｙａｍｍｏｎｉｕｍｎｉｔｒａｔｅ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅｒｏｏｔｓ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ７(１):１６８８５.[１７]ＸｕａｎＷꎬＢｅｅｃｋｍａｎＴꎬＸｕＧＨ.Ｐｌａｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎ:ｓｅｎｓ￣ｉｎｇａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ３９:５７－６５.[１８]ＨｏＣＨꎬＬｉｎＳＨꎬＨｕＨＣꎬｅｔａｌ.ＣＨＬ１ｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｓａｎｉｔｒａｔｅｓｅｎｓｏｒｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２００９ꎬ１３８(６):１１８４－１１９４. [１９]ＳｔｒａｕｂＴꎬＬｕｄｅｗｉｇＵꎬＮｅｕｈäｕｓｅｒＢ.ＴｈｅｋｉｎａｓｅＣＩＰＫ２３ｉｎｈｉｂ￣ｉｔｓａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１７ꎬ２９(２):４０９－４２２.[２０]ＴａｎｇＲＪꎬＷａｎｇＣꎬＬｉＫＬꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｃａｌｃｉｕｍｓｉｇ￣ｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋ:ｕｎｉｆｉｅｄｐａｒａｄｉｇｍｆｒｏｍ２０ｙｅａｒｓｏｆｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ２５(６):６０４－６１７. [２１]ＨａｏＤＬꎬＺｈｏｕＪＹꎬＹａｎｇＳＹꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ２１(１０):３５５７.[２２]朱云娜.菜心ＢｃＡＭＴ１ｓ在铵硝营中调控铵吸收的作用机理研究[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２０１８.[２３]ＬｉｖａｋＫＪꎬＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－ΔΔＣＴｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２－４０８.[２４]ＳｔｒａｕｂＴ.Ｐｌａｎｔａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ(ＡＭＴ)ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｄ].Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ:ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｏｈｅｎｈｅｉｍꎬ２０１６.[２５]翟莹ꎬ邱爽ꎬ张军ꎬ等.大豆中３个Ｄｏｆ转录因子的生物信息学及表达分析[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１９ꎬ３４(６):１４－１９.９㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析。
不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒相关蛋白的功能鉴定的开题报告
不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒相关蛋白的功能鉴定的开题报告一、研究背景和意义不结球白菜（Brassica rapa subsp. Chinensis）是我国一种重要的叶菜类蔬菜，具有丰富的营养成分和药用价值。
然而，受到气候等外界环境因素的突变，不结球白菜的生长和产量受到了很大的影响。
因此，研究不结球白菜的抗逆力和耐受力机制，对于推动其优化栽培、增加产量、改善品质等具有重要的意义。
转录因子是调控基因表达的一个重要类别，其在植物对于各种环境因素的适应和反应过程中发挥着重要的作用。
因此，本研究拟通过克隆不结球白菜抗逆相关转录因子的基因序列，以期发现在环境变化中发挥关键调控作用的基因。
同时，本研究还将分析不结球白菜中的耐热耐寒相关蛋白，以期深入研究植物如何适应复杂的环境变化，并为其栽培提供理论依据。
二、研究内容和方法1. 克隆不结球白菜抗逆相关转录因子基因序列通过文献研究和基因数据库搜索，选择合适的引物设计PCR扩增目标基因，然后进行克隆和测序。
得到的序列将进行生物信息学分析、同源性比对和系统进化分析等。
2. 对不结球白菜中的耐热耐寒相关蛋白进行功能鉴定利用相关手段进行纯化和分离，然后通过Western blotting等方法鉴定其功能。
同时，本研究还将探究这些蛋白的表达模式和分布情况，并分析其与环境因素的关系。
三、预期结果与意义通过本研究，预期得到不结球白菜抗逆相关转录因子基因的完整序列，并发现其在环境变化中的重要调控作用。
同时，所鉴定的耐热耐寒相关蛋白也将对研究不结球白菜的适应机制提供更多线索。
这些结果将为解决不结球白菜生长和产量受限等问题提供重要理论依据和实践指导。
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青花菜BZR1、BES1转录因子的克隆与功能分析青花菜(Brassica oleracea var.italica)是发达国家进口量最大的蔬菜之一,含有迄今为止在蔬菜中发现的抗癌活性最强的天然活性物质—萝卜硫素(Sulforaphane)。
萝卜硫素的合成前体是芥子油苷(Glucosinolate),是一种含氮和硫的次生代谢物,其广泛存在于十字花科植物中,对植物响应生物或非生物胁迫具有很重要的作用,且其部分降解产物对人体具有很强的保健功能。
因此,其合成调控分子生物学近年来逐渐成为研究热点。
油菜素内酯(Brassinosteroids,BRs)作为植物特有的一类类固醇激素,广泛参与植物生长发育和响应环境的过程。
BZR1(brassinazole-resistant 1)和BES1(BRI1-EMS-suppressor)是油菜素内酯信号转导途径中的两个重要转录因子,已在拟南芥中证实油菜素内酯可以通过BZR1和BES1抑制植物体内芥子油苷的生物合成。
萝卜硫素和芥子油苷在青花菜中含量最为丰富,BZR1和BES1转录因子是否影响其在青花菜中的合成以及如何影响?目前尚不清楚。
为此,本研究从青花菜中克隆了 BZR1和BES1基因,并进一步分析了其表达模式和功能,主要研究结果如下:(1)根据青花菜同属(芸苔属)物种的BZR1和BES1转录因子核苷酸序列,设计特异性引物,通过RT-PCR技术,从高萝卜硫素青花菜"福青1号"叶片cDNA中扩增得到油菜素内酯信号转导途径中的转录因子BZR1和BES1的同源序列,其长度分别为993bp、1011bp,分别编码330和336个氨基酸,并分别命名为BoBZR1和BoBES1。
生物信息学分析发现,克隆的这两个基因的核苷酸序列与NCBI上已登录的其他物种的同类基因相似性较高,含有典型的N末端结构域和C末端转录激活结构域。
初步确定它们为青花菜BoBZR1和BoBES1基因。
(2)分别构建了BoBZR 和BoBES1基因的亚细胞定位载体pEGAD-BoBZR1和pEGAD-BoBES1,并转化本氏烟草中进行瞬时表达。
结果表明,BoBZR1和BoBES1蛋白定位在几乎整个细胞中,当外源喷施BR后,融合蛋白全部集中在核内,表明植物细胞接收到BR信号后,转录因子BoBES1和BoBZR1被激活,进入细胞核内部行使功能。
(3)qRT-PCR分析表明,BoBZR1和BoBES1基因在根中表达量均最高,在花球中最少,在种子中几乎都检测不到。
当对其叶片进行外源喷施500 μM的甲基茉莉酸甲酯(MeJA)、5 mM的水杨酸(SA)和3 μM的BR后,青花菜中BZR1和BES1基因的表达量分别在处理24 h、8 h、24 h后达到最大值;在处理48 h后,除了 BR处理组的基因表达量稍微降低,其他两种处理均趋于初始状态。
(4)构建了以35S启动子驱动BoBZR1和BoBES1基因表达的植物超表达载体pBI-BoBZR1和pBI-BoBES1,并转化到野生型拟南芥Col-0中。
对T3代转基因拟南芥纯合体的表型分析和芥子油苷含量检测发现:两种基因超表达植株均出现植株矮小以及发育迟缓的表型,而BoBES1基因超表达受到的影响更大,叶片变小且出现卷叶。
与野生型拟南芥Col-0相比,BoBZR1和BoBES1基因超表达都会降低拟南芥中短链脂肪族芥子油苷(3MSOP、4MSOB、5MSOP、4MTB)和长链脂肪族芥子油苷(8MSOO)的含量,其中BoBES1基因超表达显著降低拟南芥中芥子油苷的含量。
结果说明BoBZR1和BoBES1基因的表达对芥子油苷的合成具有显著的抑制作用。
(5)构建了BoBZR 和BoBES1基因的干扰表达载体,并与上述超表达载体一起分别转化到青花菜中,已获得T0代抗性苗110株,其中转BZR1和BES1基因干扰
表达载体的植株分别28株和26株,转超表达载体的植株均28株。