仪器分析课件4.2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪ppt课件
高压泵应具有以下性能
流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常20~30MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.01~10mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修
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根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵
进样装置 （正面）
进样装置 （背面）
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图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，
样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品 注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的 流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。
的出峰顺序相反。
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2. 流动相类别
按流动相组成成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。
反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的
键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
《仪器分析》教案课件PPT-第5章 高效液相色谱法PPT文档
2017-动相为液体，固定相为固体吸附剂。根据不同组分在固定 相上的吸附能力不同而加以分离。
吸附剂
溶质 溶剂
2017-6-620
吸附剂
二、液液分配色谱法（LLC）
流动相和固定相都是液体。 分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
第五章高效液相色谱法
HighPerformanceLiquidChromatography HPLC
气相色谱中的“气相”代表什么意思？ 气相色谱：流动相是气体 液相色谱：流动相是液体
2017-6-62
第一节高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法（HPLC） 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色 谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离 柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分
尺寸排阻色谱法的分离机制：体积排阻效应
样品分子 凝胶珠
流动相
溶质在两相间不 是靠其相互作用 力的不同来进行
分离； 而是按照分子大 小进行分离的； 大分子物质先洗 脱出来，小分子
2017-6-626物质后洗脱出来
孔道
凝胶珠内具有一定大小的孔穴， 体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出 来； 中等体积的分子部分渗透；
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六通阀
高压泵
进样前
色谱柱
进样中 （Load）
进样后 （Inject）
4.色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，柱内径 4.6mm或3.9mm，长度15～30cm，不 锈钢柱，填料颗粒5～10μm，柱效为 7000～10000理论塔板数/m。
高效液相色谱仪课件完美版PPT资料
• 样品 1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样 品中不含固体颗粒；
2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，
则极性比流动相大；若为正相柱，则极性
比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量 用流动相制备样品液；
3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量 管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
• 色谱柱： 1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围， 如pH值范围、流动相类型等； 2、 使用符合要求的流动相； 3、 使用保护柱； 4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先 用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲 洗。
高效液相色谱的特点
• 高压——压力可达150～300 kg/cm2。色 谱柱每米降压为75 kg/cm2以上。
• 高速——流速为～10ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ0 mL/min。 • 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱
中同时分离成份可达100种。 • 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达。同
时消耗样品少。
主要分离类型
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内。
液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。 如分析氨基甲酸 酯农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快, 如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。
高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。
在一根柱中同时分离成份可达100种。 亲和色谱：利用生物大分子与固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择分离。
操作过程中应注意的事项
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
高效液相色谱仪介绍课件
谢谢
号
05
数据处理系统： 处理和分析色
谱数据
06
07
流动相储液瓶： 储存流动相
废液收集器： 收集废液
08
泵管路：连接 各部件，保证 流动相的流通
09
10
温度控制系统： 控制色谱柱和 检测器的温度
安全保护装置： 保护操作人员 和仪器的安全
高效液相色谱仪的工作原理
高效液相色谱仪是一种利用液体 作为流动相的色谱分析仪器。
安装
定期校准与保养
01
定期检查仪器的 各个部件，确保
其正常工作
02
定期更换易损部 件，如泵密封圈、 进样阀密封圈等
03
定期进行仪器校 准，确保分析结
果的准确性
04
定期清洁仪器， 保持仪器的清洁
和干燥
05
定期检查仪器的 电源和接地线，
确保安全使用
06
定期记录仪器的 使用情况和维护 保养情况，便于 日后查询和分析
农药分析
农药残留检测： 检测农产品中的 农药残留，保障
食品安全
农药质量控制： 监控农药生产过 程中的质量，确 保产品质量合格
农药环境污染监 测：监测环境中 的农药污染，评
估环境风险
农药研发：辅助 农药研发，提高 研发效率和质量
环境监测
01
水质监测：检测水中的污染物和化学物质
02
空气监测：检测空气中的污染物和化学物质
药物代谢：研 究药物在生物 体内的代谢过 程和机制
药物相互作用： 研究药物之间 的相互作用和 影响
3
高效液相色谱 仪的发展趋势
仪器自动化
仪器操作自动化：通过计算机控 制，实现仪器的自动化操作
数据处理自动化：自动采集、处 理和分析数据，提高分析效率
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
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4.2.1 液相色谱仪与结构流程
2020/10/28
液相色谱仪（4）
2020/10/28
液相色谱仪（5）
ห้องสมุดไป่ตู้2020/10/28
液相色谱仪（6）
2020/10/28
1. 结构流程
2020/10/28
2020/10/28
4.2.2 主要部件
(1) 高压输液泵
第四章 高效液相色谱法和 超临界流体色谱法
High performance liquid chromatography and Supercritical fluid chromatography
第二节 高效液相色谱仪
instrument of HPLC
4.2.1 高效液相色 谱仪与结构流程
4.2.2 主要部件
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光电二极管阵列检测器
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三维：光谱-色谱图
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c. 示差折光检测器
（Differential refractive index detector）
除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度成正比。
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，将
两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室，混合后 进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比例调
节阀,将两种或多种不同极性 的溶剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
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(3) 进样装置
流路中为高压力工作状 态，通常使用耐高压的六通 阀进样装置，
结构如图所示：
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(4) 高效分离柱
柱体为直形不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 检测器
紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 光电二极管阵列检测器
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4.2.3 检测器
a. 紫外检测器
通用型检测器（每种物质 具有不同的折光指数）。
灵敏度低，对温度敏感， 不能用于梯度洗脱。
偏转式、反射式和干涉型 三种。
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示差折光检测器
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d. 荧光检测器
（Fluorescence detector）
高灵敏度，高选择 性。
对多环芳烃，维 生素B，黄曲霉素，卟 啉类化合物，农药， 药物，氨基酸，甾类 化合物等有响应。
应用最广，对大部分有机 化合物有响应。
特点：
灵敏度高； 线性范围宽； 流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
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b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测 特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。
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请选择内容
4.1 高效液相色谱法的特性 4.2 高效液相色谱仪 4.3 液相色谱的固定相与流动相 4.4 液相色谱中的主要分离类型 4.5 液相色谱分析条件的选择 4.6 高效液相色谱法的应用 4.7 离子色谱法 4.8 超临界流体色谱法
结束
2020/10/28
主要部件之一，压力：150×105～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、 高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特 性。
（动画）
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(2) 梯度淋洗装置