基因图位克隆的策略与途径
图位克隆的基本原理和方法常用资料
基因图位克隆的详细流程与注意事项
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植物基因的图位克隆
植物基因的图位克隆关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案引言随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域的重要课题。
图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因的研究中发挥重要作用。
本文将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、应用及面临的挑战和解决方案。
主体部分一、植物基因图位克隆的技术原理和应用植物基因图位克隆是一种基于基因组图谱的基因克隆技术，其基本原理是在基因组图谱中找到与目标基因相关的DNA片段，然后通过分子生物学方法克隆出该基因。
该技术在植物基因功能研究中的应用主要体现在以下几个方面：1、揭示基因与表型特征之间的关系：通过图位克隆技术，科学家们可以克隆出与特定表型特征相关的基因，进而研究其功能和作用机制。
2、发掘抗逆基因资源：植物在逆境条件下常常表现出独特的适应性，图位克隆技术可以帮助我们克隆这些抗逆基因，为作物改良提供宝贵资源。
3、解析植物发育过程中的关键基因：通过图位克隆技术，可以克隆出植物发育过程中发挥关键作用的基因，深入研究其调控网络和作用机制。
二、植物基因图位克隆的实验流程和操作植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植物组织样本。
2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征或生理特性相关的候选基因。
3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。
4、基因克隆：根据定位结果，设计特异性引物，采用PCR等分子生物学方法，克隆出目标基因的完整序列。
5、功能验证：通过转录组分析、蛋白表达及互作等实验手段，验证目标基因的功能及其在植物生长发育和抗逆过程中的作用。
三、植物基因图位克隆的挑战和解决方案尽管植物基因图位克隆技术已取得许多突破性成果，但在实际应用中仍面临一些挑战，如基因表达水平低、基因组规模大等。
基因图位克隆的策略与途径
基因图位克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的通常特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包含农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都务必首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或者分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
图位克隆
序列(CAPS)，它也是基于PCR 的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS (dCAPS) (Michaels and Amasino,1998; Nam et al., 1989)可把任何已知的点突变 作为分子标记，只要在PCR 时引入不配对 的引物，使扩增的序列在一个生态型中具 有限制性酶切位点，而在另一生态型中没 有，以形成多态性。
2.4 目的基因的筛选和鉴定
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个 关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分 子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后， 就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐 靠近目的基因。
染色体步移是指利用已知的阳性克隆称为 “二次克隆”，如此反复即可取到所需要的克隆，获 得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过 一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断；当克 隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。为 克服这些弊端，Tanksley 等(1995)又发展了染色体登 陆的方法。
2.粒是一种含有噬菌体的Cos 位点的质粒载 体， 大小在5~7Kb 左右， 可高效地克隆25~35Kb 的DNA 片段。人工染色体的插入片段最长可达 2Mb 左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展 的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA 时，需要YAC 作载体。以YAC 为载体，可将 300~1 000Kb 的DNA 片段克隆。因此，以YAAC、PAC 等几 种以细菌为寄主的载体系统。
1 图位克隆技术的原理
功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础 上，用id 等)，从 而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱 通过染色体步移(chromosome walking) 逼近目的 基因或通过染色体登陆(chromosome landing) (Tanksley et al., 1995)方法最后找到包含有该目 的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基 因功能。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
图位克隆的基本原理和方法
r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
R/r
F2
R/R
R/r
r/r
primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
精细定位
• 扩大群体，进行精细定位
Complementation test
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因， 可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的 生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话 就是构建互补载体做一个互补验证。
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
图位克隆的基本原 理和方法
何宗顺 2011.12.7
图位克隆的基本原理
其基本的原理是： 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到 与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对 目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发 布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基 因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目 的基因功能。
文档图位克隆原理及应用
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。
正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。
3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。
缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。
4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。
BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。
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基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种模式植物，具有基因组小(125Mbp ) 、生长周期短等特点，而且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属十字花科(Cruciferae),具有高等植物的一样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，专门是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活紧密有关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第一将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.用该方法分离基因是按照目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先明白基因的DNA 序列，也无需预先明白其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力差不多大大减少了(图1)。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时刻。
在那个 过程中，我们从选择突变体开始，逐步找到和表型有关的基因。
这和反向 遗传学（reverse genetic9的方法正好相反。
图位克隆能实现，关键在于全 基因组测序打算的完成和各种分子标记的发觉。
这些数据被储存在专门的 数据库中（表 1）（ Lukowitz 等，2000）。
表1拟南芥网络资源网站网址Supplemental material for this paper /methods/ppsuppl.html Nottingham Stock Centre ( U.K.) /Recombinant Inbred map /new_ri_map.html Ohio Stock Center (U.S.A.) /aims/TAIR database*， homepageRecombinant Inbred map ( mirror site )CAPS markersSequence tableSNP collectionCEREON collection of polymorphismsSSLP markers/SSLP info/SSLP.htmlTIGR ， genome annotationsDatabase of Ler sequencesKasuza DNA Research Institute ， genome annotationsMIPS genome annotationshttp://websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions"1995Total ■畑rV3 persod-yBar-s-2002TotH=1 porsion-yvEu-«f Q IN 样an<S vitciblM! rruricoTEOKaii<jhRftj riwj<iMj ：u*ar msarfcor iSr •"皿1曲畑Durid ptiy^ic-aJ m-np (YACta a iXZTlK 如Ptw/wMi map甘耳OffMwviorb marker fmm ¥AC* or ccMTTikdBFbrwrf ?%nJilLc mnpping20 kiap 帕石0|扁0!叭ClTic^^ M *I vunrh r 巾和叭 C«f>Kn dawhiAM.htu ONA voqu 口nee 1 tor -C4Odl<Mil« BV&MtHOGde andUrmn eftr nene? Est^i-aridingMerrily oarwSiCjate ejerwii Fwrn C«K> vwwio*(□住釣口口 «*011 tpri-nwim frewTi Cd-O, rhen aoquencaKey in FHftp«b«ft4Kli G I GHIIFTQ process Fk&t-p4a* nwpijlT'bgi 存Q烈M r*»H<i|irtwri|Gen<?r«it9 ptiyvi^Al mApCo reefer cnrdinlAtnmn 世屛 Final iriftmiifiiioaitloin ofmu 怕"dn*注：The Arabidopsis Information Resource (TAIR )在拟南芥中的图位克隆，在专门大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。
实现基因图位克隆的关键是选择与目标基因连锁的分子标记。
实质上，分子标记是一个特异的DN A片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。
迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的选择（Wang等，2000）。
其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNP s）。
SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测专门直截了当，然而我们需要设计引物来检测假定的SSLP 标记；对SNPs标记的检测也比较直截了当，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差不，这些差不的核苷酸通常位于非编码区域（Peters 等，2003）。
最常见的用于检测SNPs标记的方法要紧是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS （dCAPS）（Nam等，1989; Michaels 和Amasino，19 98）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。
图位克隆法随着有关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。
表2用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所关心。
2图位克隆的一样过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直截了当。
图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。
从基于C ol-0和Ler遗传背景的突变体动身，我们有可能在大约一年时刻内找出与那个突变有关的基因，这其中要紧耗时刻的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。
作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者Ler）的植株杂交。
在大多数情形下，用于杂交的突变体植株是作为父本依旧母本是没有关系的。
然后播种F1代种子。
在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。
F1代植物的表型的显现或者消逝将显示着我们所研究的突变是显性的依旧隐性的。
最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。
因此也有必要确认原先的生态型背景。
图2图位克隆过程示意图（Jander 等，2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的 粗定位（first-pass mapping ,图2）。
在其生长过程中，我们可确定其表型， 大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情形下是纯合突变体， 在显性突变的情形下是纯合野生型）。
然后从这150个个体的叶子或者其它 组织中制备DNA 用于基因型分析。
起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距 20 cM ）进行分析，确定突变基因 是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包 含突变基因的大约20 cM 的遗传间隔。
一旦如此的一个遗传间隔被定义之 后，接下来的工作确实是引入新的标记把那个间隔缩小到大约4 cM 。
一样来讲，利用150个F2代个体是在专门大程度上能找到如此一个遗传间隔的， 距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分 析。
下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fi ne-resolution mapping ，图2）。
最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小 到40 Kb 甚至更小（这在拟南芥中大约是 0.16 cM ）。
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