产品无菌方法验证
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证1. 概述将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。
2. 验证前提条件供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。
种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。
照此原则,多规格制品按下表选择供试品进行验证。
3. 验证方法3.1菌液制备3.1.1细菌菌液制备程序①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。
用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。
②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜面上，于30~ 35°C培养18h~24h。
取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。
③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
无菌检验方法验证方案
无菌检验方法验证方案1.引言无菌检验是对物品或产品进行微生物污染检测的一种方法。
验证无菌检验方法的准确性和可靠性是确保检验结果准确的关键因素。
本方案旨在提供一种有效的无菌检验方法验证实施方案。
2.目的验证无菌检验方法的准确性和可靠性。
3.系统概述本方案包括以下主要步骤：-设计验证实验方案-准备验证试验样品和无菌试验介质-运行验证试验-分析结果并评估方法的准确性和可靠性-编写验证报告4.设计验证实验方案根据实际情况，设计验证实验方案，包括验证试验的样品数量、样品类型、试验方法和实验条件等。
根据实际情况，选择合适的无菌检验方法进行验证。
5.准备验证试验样品和无菌试验介质根据验证实验方案，准备验证试验所需的样品和无菌试验介质。
确保样品和介质的质量符合要求，并严格遵守洁净操作程序，防止试验过程中的污染。
6.运行验证试验按照验证实验方案，进行验证试验。
严格按照无菌检验方法的要求进行操作，确保试验过程的准确性和可靠性。
对样品和无菌试验介质进行适当的控制，以确保试验结果的可靠性。
7.分析结果并评估方法的准确性和可靠性根据验证试验的结果，进行数据分析。
对验证试验过程中的任何问题进行评估，并判断无菌检验方法的准确性和可靠性是否满足要求。
如果发现问题，需要进行适当的调整，并重新运行验证试验。
8.编写验证报告根据验证试验结果，编写验证报告。
报告应包括验证试验的目的、方法、结果和结论等。
报告应清晰、准确地描述验证试验过程和结果，并提出相应的建议。
9.结论通过验证实验方案的实施，可以评估无菌检验方法的准确性和可靠性。
如果验证结果表明方法可靠，可以继续使用该方法进行无菌检验。
如果验证结果不满足要求，需要对方法进行修订或选择其他合适的方法。
总之，无菌检验方法的验证是确保检验结果准确的重要步骤。
通过设计合理的验证实验方案、准备样品和无菌试验介质、运行验证试验、分析结果并评估方法的准确性和可靠性，可以有效地验证无菌检验方法的准确性和可靠性，并提供一份详尽的验证报告。
无菌检查方法验证报告
无菌检查方法验证报告目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 接受标准 (3)4. 抽样计划 (3)5. 设备、试剂和菌种信息 (3)6. 试验步骤 (4)7. 供试品检查 (6)8. 结论 (6)9. 再验证周期 (6)10. 附件清单 (6)1.目的支据中国药典2020版无菌检查法的要求，对产品的无菌检查法进行验证，以确定一种无菌检查的方法能有效的消除该产品对微生物的抑制作用，从而证实该方法的有效性和实用性。
2.适用范围适用于本司产品的无菌检查。
3.接受标准与阳性对照比较，含供试液各容器中的试验菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉）均生长良好，则可照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
如含供试品的任一容器内的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，需进一步改进检验条件再进行方法验证试验。
4.抽样计划随机抽取灭菌后的样品24份。
具体信息见表一：表一样品信息确认人/日期：复核人/日期：5.设备、试剂和菌种信息5.1设备信息详见表二表二设备信息确认人/日期：复核人/日期：5.2试剂信息详见表三：表三试剂信息确认人/日期：复核人/日期：5.3菌种信息详见表四：表四菌种信息确认人/日期：复核人/日期：5.3.1菌液的制备用接种环取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取生孢梭菌的第三代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的第四代培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的第三代培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。
以上操作均在微生物检验室阳性菌室的生物安全柜中进行。
无菌检查法及其验证
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基都有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
第14页
培养基适用性检验
⑤结果判断 空白对照应无菌生长, 若加菌培养基管均
生长良好, 判该培养基灵敏度检验符合要 求。 试验同时应做空白对照
无菌检查法及其验证
第15页
培养基说明
无菌检验培养基所能支持生长微生物是有 限。
无菌检验法概念
• 无菌检验是经过目检微生物在培养基中 生长来判断结果。
• 无菌检验只能给出该批产品受污染程度。 • 无菌检验合格只能说明被测样品无菌，
不能证实整批样品无菌。
无菌检查法及其验证
第1页
无菌检验设施、环境、人员
• 检验环境应在洁净度10000级下局部洁 净度100级单项流空气区域内或隔离系 统中进行, 其全过程必须严格恪守无菌操 作。
无菌检查法及其验证
第8页
培养基储存
• 制备好培养基应该保留在2-25℃、避光环 境, 若保留于非密闭容器中, 普通在3周内使 用；若保留于密闭容器中, 普通可在1年内 使用。
• ※应结合实际情况进行验证, 以确定培养基 使用期。
无菌检查法及其验证
第9页
培养基适用性检验
本检验可在供试品无菌检验前或与供试品 无菌检验同时进行。
液冲洗滤膜, 冲洗次数不得少于三次。 冲洗后, 如用封闭式薄膜过滤器, 分别将100ml硫
乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入对应 滤筒内。 假如采取普通薄膜过滤器, 取出滤膜, 将其剪成3等 份, 分别置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改 良马丁培养基容器中, 其中一份做阳性对照用。
无菌检查法及其验证
• 隔离系统按相关要求进行验证, 其内部环 境洁净度须符合无菌检验要求。
无菌、微生物限度检查及方法验证
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
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琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]
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产品无菌方法验证
一、概述
1、简介
无菌检查法是指检查无菌药品、医疗器械等是否无菌的一种方法。
无菌检查是在洁净度百级的单向流空气区域内进行，其全过程严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
本验证方案参考《中华人民共和国药典2010版二部》附录无菌检查法和GB/T19973.2-2005/ISO 11737-2:1998 医疗器械的灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程的无菌试验。
二、验证目的
通过对无菌方法的培养基适用性检查、无菌检查方法的适用性检查，并且结果符合规定，证明培养基的适用性以及无菌检验方法的适用性，以达到用适合的方法对样品进行无菌检查的目的。
三、范围
本验证方案适用于X公司医疗器械无菌检查方法。
本文件规定了无菌验证的程序、方法、标准和记录。
四、验证参考文件
五、验证人员及职责
1质量部QC：负责验证计划、方案起草、按监控计划执行，做好检验工作，并进行记录，出具报告。
2质量部：质量部经理负责验证方案的审核、记录的审核和报告的审核。
按文件管理要求，作好验证方案文件的控制工作。
六、验证内容
1、验证试验项目
1.1 培养基的的适用性检查。
1.2方法适用性检查
2、验证实施步骤
2.1 所用培养基
胆盐硫乙醇酸盐流体培养基
改良马丁培养基
2.2 培养基的配制
硫乙醇酸盐流体培养基：称取硫乙醇酸盐流体培养29.3g，加入蒸馏水或去离子水1L，煮沸至完全溶解，分装试管，121℃灭菌15min。
改良马丁：称取改良马丁28.5g加入蒸馏水或去离子水1L，搅拌加热至完全溶解，分装试管，121℃灭菌30min。
2.3 菌悬液配制
所用菌种：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941
白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 用无菌生理盐水将所用菌种稀释至30-100CFU/ml（2～8℃保存24h内使用）。
2.3 检验方法以及培养条件的选择
依据产品特点和标准推荐，优先选用直接浸泡于生长培养基（硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基）中，然后硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别在23～28℃和30～35℃培养14天，逐日观察，并记录结果。
2.4 培养基的适用性检查
2.4.1 培养基的无菌检查
硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基分别取5支，培养14天，应无菌生长。
2.4.2 灵敏度检查
2.4.2.1 接种
取每管装量12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种作空白对照,培养3天；取每管装量9ml的改良马丁培养基5管，分别接种白色念珠菌、黑曲霉2支，另一支不接种作空白对照，培养5天。
逐日观察结果。
2.4.2.2 结果判断
空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
2.5 无菌方法适用性检查
2.5.1 接种
取装量为25ml的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄的葡萄球
菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取装量为25ml的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。
其中一支加入一个单位的样品，另一支作对照，置同培养基适用性检查培养条件相同的条件培养3～5天。
2.5.2 结果判断
与对照管比较，含样品的各管试验菌均生长良好，则可以按照此检验方法和检验条件进行供试品检查。
注：方法验证试验也可以与样品的无菌检查同时进行。
3、验证记录
3.1 培养基适用性检查记录
3.2 无菌检查方法适用性检查记录
七、验证结论
验证结果符合标准规定，则本检验方法（直接浸泡法）和检验条件适合本公司产品的无菌检查。
报告人：日期：审核人：日期：。