flowjo分析细胞周期
Flow Jo软件分析细胞周期样品
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张千 君
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（图一 ）
FlowJo分 析细胞周期数据 的过程
1. 把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)所示：
(图 二 )
X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。 2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三 ）所示：
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Flow Jo软件分析细胞周期样品
细胞周期检 测的原理：
核酸染料可以与DNA分子特异性的结合，细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择 性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流 式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。 细胞周期示意图如（图一 ）所示
已有 1394 次阅读 2012-3-20 12:20 | 个人分类:FlowJo使用 | 系统分类:科研笔记 | 关键词:FLOWJO软件, 流式数据，细胞周期分析，
利用流式细胞术分析细胞周期时相
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用
掌 握 用 流 式 细 胞 仪 测 量 细 胞 群 体 DNA 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱
膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）
• 800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2次 • 用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎） • 加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ，37℃水浴消化30 min； • 加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。 • 用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测 • 样品分析测定及打印
了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 实验目 的 通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白 质、抗原等物理及化学特征。 实 验 原理
取对数生长期细流胞，式倒细去培胞养液仪，的胰酶工适度作消原化细理胞，是用将培养待液吹测打细，8胞00rp放m ,入离心样15品mi管n去上中清，。 在气体的压力下 实用验300利目进用（流孔入式径充细40胞~满5术0微分鞘米析液）细尼胞的龙周网期流过时动滤相，室上机。检在测 鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷 加RNas出e-A，约3形µL至成终细浓度胞约为柱50。µg/m通L ，过37对℃水流浴消动化液30 m体in；中排列成单列的细胞进行逐个检测，得
流式细胞术分析细胞周期时相 流式细胞术在科学研究中的应用 了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用 仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱
流式细胞检测服务之细胞周期
流式细胞仪分析DNA（细胞周期）通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，借此可以了解细胞的增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
正常细胞具有较恒定的DNA含量，而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常是很常见的。
这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来，这一指数对于肿瘤的早期诊断，交界瘤、间叶组织肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。
细胞周期操作步骤：1. 收获细胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗细胞。
2. 1000rpm离心10分钟，弃上清。
3. 逐滴加入5ml或更多预冷的70-80%的乙醇，涡旋混匀细胞，4°C避光过夜（>18小时）。
4. 1000-1500rpm 离心细胞10分钟，弃上清。
之后清洗细胞2次以去除所有的乙醇。
注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（货号：554656）。
5. 细胞染色：每管样本需10^6细胞。
具体操作如下：1) 对于PI/RNase 染色，将细胞重悬于0.5 mL PI/RNase 染色液（货号：550825）。
2) 对于7-AAD染色，将细胞重悬于0.1 mL 染色液（货号：554656），同时加入20 μL7-AAD 染色液（货号：559925）6. 室温避光孵育15分钟。
7. 分析前4°C避光保存样本。
1小时之内上流式细胞仪检测。
正常细胞周期分析细胞周期检测所需产品：使用说明：DNA染料，尤其是PI，具有较强的粘性。
样本上机检测之后，应遵照仪器说明书仔细清洗流式细胞仪，以免对下一位操作者结果造成影响。
固定好的细胞可保存长达12个月(储存于70-80% 的乙醇，置于-20°C保存).。
流式分析细胞周期
流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。
望专家教教我是哪里出错。
做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。
过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。
3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。
流式细胞仪检测细胞周期
流式细胞仪检测细胞周期
周期分析
操作篇
写在前面
流式细胞术的原理篇我先卖个关子，先来个简单的周期分析操作篇~
通过流式细胞术进行DNA周期分析，可以测定细胞的DNA含量哦~
准备工作☞☞☞制备单细胞悬液于200 μl的PBS缓冲液中；加入2 ml预冷的70%乙醇，4 ℃保存；
步骤
1.肿瘤细胞按300,000-500,000细胞/孔接种于6孔板中；24小时后，加入药物；24-72小时后，EDTA消化并收集细胞，取单细胞悬液1-2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；
2.1500 rpm离心5分钟，弃上清，反复两次；
3.重悬细胞于0.5 ml PBS缓冲液中（第二次在eppendenf管中）；
4.加入1 ml冷75%乙醇，混匀，保存于4 ℃（或-20 ℃），至少30分钟。
在-20 ℃条件下可保存2-3周；
5.1500 rpm离心5分钟，去上清，用500 μl PBS重悬细胞，加入5 μl RNaseA消化，去除RNA影响；
6.加PI染液5μl重悬细胞，室温避光20-30分钟；
7.若有明显的黏附，需再用筛网过滤；
8.上机检测。
488 nm激发波长测定。
注意：
1.根据实验的要求，固定剂也可选用1-3%多聚甲醛；
2.将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0-4 ℃；
3.细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓
度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）；
4.单细胞浓度应为106/ml，以免影响CV值和检测结果。
利用流式细胞术分析细胞周期时相
细胞生物学实验
流式细胞术分析细胞周期时相
• 实验目的 • 实验原理 • 仪器、材料与试剂 • 实验步骤 • 实验报告及思考题
实
验
目
的
பைடு நூலகம்
掌握流式细胞仪的工作原理 掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA 含量分布的方法 了解流式细胞术在细胞生物学研究中 的应用
细胞周期时相分析
细胞周期时相分析
仪器、材料与试剂
仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱 材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips 试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存），
PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃)
实
验 原 理
流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下 进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷 出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得 到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋 白质、抗原等物理及化学特征。 细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA 含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪 对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。
细胞周期时相分析
实验报告及思考题
实验报告
标明你所测定的样品中各周期时相的百分比？
思考题
1. 2.
流式细胞术在科学研究中的应用 本实验为何要采用对数生长期的细胞？
细胞周期时相分析
细胞周期时相分析
流式分析方法
Flowjo 是现在最受欢迎的流式数据分析软件，由于它简朴易用并且十分有效。
则本文将其基本操作以及对细胞凋亡和细胞周期的 Protocol 分享给大家。
1.打开 Flowjo 软件双击桌面 FlowJo 软件图标，进入软件工作台。
或软件工作台由菜单栏、惯用工具栏、组空间和样本空间构成。
2.F lowjo 分析单标样本单标记样本数据惯用的显示方式是单参数直方图。
普通横坐标能够是线性标度或对数标度，代表着所检测的荧光或散射光的强度；纵坐标表达的是横坐标某一特定荧光强度的细胞数，有时也用相对比例来体现。
以 3 color comp 文献夹中的 CyPE comp.fcs 进行分析演示。
将此文献夹移至桌面，并把该数据文献夹从桌面拖入 Flowjo 中的组空间中。
在组空间中单击选中“3 color comp”组，此时在样本空间里显示“3 color comp”组中的全部样本。
而后在样本空间中双击“Cy5PE comp.fcs”，出现图形窗口。
此为二维点图，X 轴选择 SSC（侧向散射，细胞内颗粒构造越复杂，质量越大，SSC 越大，反之越小。
）Y 轴选择 FSC（前向散射，细胞越大，FSC 越大；反之越小。
）选择设门工具（矩形门、椭圆门、多边形门、自动门）中的任意一种，在二维点图中选中淋巴细胞。
在图形窗口中双击选中的淋巴细胞，生成新的图形窗口。
在 X 轴选择 Cy5PE:CD4，Y 轴选择 Histogram，选择设门工具（区域门、双分门）中任意一种，在单参数直方图中设门。
3.F lowjo 分析多色标样本多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。
横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一种点表达含有对应坐标值的细胞。
以三标记样本为例，选择 3-color-experiment 文献夹中的 931115-B02- Sample01.FCS 进行分析演示。
同样，在在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤欧阳学文取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP 管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C——Flowjo软件分析FCMDNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。