利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、 ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。
下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。
一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。
在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。
PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。
4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。
5.使用流式细胞仪进行测量。
设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。
6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。
可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。
通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。
二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。
在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
流式细胞仪常用的几种检测方法
流式细胞仪常用的几种检测方法1.细胞计数和生存率检测：流式细胞仪可以通过测定细胞的大小、形状和胞内染色物来实现细胞计数和生存率的检测。
通过自动聚焦和自动获取图像的功能，可以对大量的细胞进行计数和分析，并得出生存率数据。
2.表面标记检测：流式细胞仪可以利用荧光染料或荧光标记抗体对细胞表面的蛋白质、糖类或其他生物分子进行检测。
这种检测方法主要用于检测细胞表面标记的数量和分布情况，例如测定细胞表面特定抗原的表达水平。
3.细胞周期分析：流式细胞仪可以通过染色剂或荧光标记抗体对细胞进行染色，然后分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。
这种检测方法可以用于研究细胞的增殖能力、细胞周期调控机制以及细胞周期与疾病发展的关系。
4.细胞凋亡检测：流式细胞仪可以利用染色剂或荧光标记抗体对细胞凋亡的标志物进行检测。
凋亡是细胞死亡的一种形式，通过测定凋亡细胞的数量和凋亡标志物的表达水平，可以研究细胞凋亡的调控机制以及细胞凋亡与疾病的关系。
5.细胞功能检测：流式细胞仪可以通过检测细胞内Ca2+浓度、ROS （活性氧物种）水平、蛋白质磷酸化等细胞功能指标来研究细胞的信号转导和功能活性。
例如，利用荧光染料可以测定细胞内钙离子的浓度变化，以研究细胞响应外界刺激的机制。
此外，流式细胞仪还可以进行细胞分选、多色细胞分析和细胞细胞间相互作用的研究。
细胞分选功能可以根据细胞标记物的表达水平将细胞分离出来，用于研究特定功能细胞的特性。
多色细胞分析可以用于同时检测多种标记物的表达水平，以揭示不同细胞类型的分子特征。
细胞间相互作用的研究可以通过检测细胞间的共聚或共表达标记物来研究细胞间的相互作用和相互影响。
总的来说，流式细胞仪是一种功能强大的实验室设备，常用于细胞生物学和疾病研究。
通过不同的检测方法，可以在细胞水平上研究细胞的数量、表面标记、周期、凋亡、功能以及细胞间相互作用等方面的特征。
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期
流式细胞术检测细胞周期（PI染色）操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中，4℃冰箱保存，待测。
10、用流式细胞仪检测细胞周期
11、用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据，并导出细胞周期分析结果
备注：
1、RNase A：贮液浓度：1mg/ml ；
工作液配制：加1 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为20ug/ml。
2、PI：贮液浓度：2.5mg/ml；
工作液配制：加2.5 mg/ml贮液10ul于500ul 1×PBS中，使终浓度为50ug/ml。
4、检测样品细胞浓度1x106 /ml。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。
它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。
流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。
流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。
细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。
在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。
细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。
G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。
接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。
而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。
1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。
同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。
如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。
如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。
3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。
细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。
同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。
4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。
利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。
根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。
流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用
用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来， 用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机
一般分选速度为每秒钟300个细胞， 大型机分选速度可达到每秒上万个细胞
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Fluorescence Activated Cell Sorting
488 nm laser
- Charged Plates
Single cells sorted into test tubes
谢 谢 大 家
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• 细胞表面/胞浆/核的特异性抗 原
• 细胞活性 • 细胞内/外的细胞因子 • 激素结合位点、细胞受体 • 蛋白磷酸化 • pH值 • 钙离子浓度 • 细胞膜电位、线粒体膜电位
……
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一） 细胞DNA含量检测
细胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙 啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光 强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个 原理，可测出细胞的DNA含量。用于细胞周期、细 胞倍体以及凋亡的检测。
3. 特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个 细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，即分选技术。
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4. 应用范围
凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细 胞仪检测。
前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光 源激发
在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机 多用的仪器。
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ros荧光实验报告
ros荧光实验报告ROS荧光实验报告引言活性氧（ROS）在细胞内起着重要的调节作用，但过多的ROS会引起细胞损伤甚至细胞死亡。
因此，对ROS的定量检测和研究对于理解细胞内氧化应激过程具有重要意义。
本实验旨在利用ROS荧光探针来定量检测细胞内ROS的水平，以及研究不同条件下ROS的变化情况。
材料与方法1. 细胞培养：选择适当的细胞系进行培养，保证细胞的健康和生长状态。
2. 荧光探针染色：将细胞培养物中加入ROS荧光探针，使其与ROS发生特异性反应并产生荧光信号。
3. 流式细胞仪检测：利用流式细胞仪检测细胞中荧光信号的强度，以定量分析细胞内ROS的水平。
4. 实验组设计：设置不同的实验组，如对照组、处理组等，研究不同条件下细胞内ROS的变化情况。
结果与讨论通过实验，我们发现在正常培养条件下，细胞内ROS的水平处于一个相对稳定的状态。
但在氧化应激条件下，细胞内ROS的水平显著上升。
此外，我们还发现不同处理条件下细胞内ROS的变化情况存在差异，这表明ROS的产生和清除受到多种因素的调节。
结论本实验利用ROS荧光探针成功地定量检测了细胞内ROS的水平，并研究了不同条件下ROS的变化情况。
这为进一步理解细胞内氧化应激过程提供了重要的实验数据。
我们相信，通过进一步的研究，将有助于揭示ROS在细胞内的作用机制，为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
结语本实验为研究细胞内ROS提供了一种简便、快速、准确的方法，对于深入理解ROS在细胞内的作用机制具有重要的意义。
我们期待未来能够通过进一步的研究，揭示ROS在细胞生物学和疾病发生发展中的重要作用。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。
以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。
根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。
2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。
碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。
RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。
磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。
流式细胞仪专用的上样管。
3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。
离心机：用于离心细胞。
二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。
2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。
3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。
4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。
5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。
三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。
2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。
乙醇的最终浓度应在 70%左右。
3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。
四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。
2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。
3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。
4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。
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利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、ROS
（以6孔板为例）
测定细胞存活率
1.取对数生长期的细胞,以4×105/ml密度接种于6孔细胞培养板上；
2.培养过夜后，用于相应实验处理；
3.收集处理后的细胞培养液至流式专用管；
4.加1ml PBS缓冲液清洗一次，清洗液加入管中；
5.胰酶消化收集细胞于上述管中；
6.1ml PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，清洗液加入离心管；
注：3－6步都收集于同一流式专用管。
7.800g离心6min，去上清；
8.加1ml PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清；
9.最后重悬细胞于500μl含5μg/ml碘化丙啶(propidium iodide,PI)的PBS缓冲液
中；
10.避光冰上孵育10min,用流式细胞仪测定细胞存活率；
11.PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成
正比，但其不能透过完整的细胞膜。
而FS（前向散射）则是指示细胞大小的参数。
因此，我们以FS为横坐标，PI的荧光值的对数（log PI）为纵坐标，就可将不同大小和不同荧光强度的细胞区分开：活细胞表现出较大的FS值和较弱的荧光强度；坏死的细胞碎片，由于丢失部分DNA，具有较小的FS值和较弱的荧光性；凋亡细胞的细胞膜具有通透性，细胞虽然聚缩变小，但核保持完整，所以显示出较小的FS值和较强的荧光强度。
通过计算活细胞占所有细胞的百分率，即可得知细胞存活率。
测定细胞周期
1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步；
2.用300μl的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700μl预冷的无水乙醇中，乙醇
终浓度为70%，4℃避光固定过夜；
3.800g离心10min，去上清；
4.PBS清洗两次；
5.重悬细胞于500μl含100unit/ml RNaseA的PBS缓冲液中，避光37℃孵育
30min；
6.加2mg/ml PI至终浓度50μg/ml，避光孵育30min，
7.以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期
各期的细胞数目。
测定胞内ROS的积聚
1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步；
2.重悬细胞于1ml的PBS缓冲液中；
3.加荧光探针如CM-H2DCFDA（主要检测H2O2，1μmol/ml），37℃孵育30
min；
4.在流式细胞仪上以FS和SS（侧向散射，指示细胞光透射程度）为参数，选
取活细胞（大FS值，较小SS值），将其限定在Gate内，对Gate内的细胞进行ROS的分析。
以相应荧光探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐标即可测定活细胞的ROS的相对强度。