液相色谱方法开发(HPLC)
液相方法开发波长选择
液相方法开发波长选择
高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，特别是在药物开发和质量控制中。
开发HPLC的方法涉及多个方面的选择与优化，其中波长的选择是非常关键的一步。
1. 找到目标化合物的峰：首先需要确定目标化合物的吸收波长。
这通常可以通过文献查阅或实验来确定。
2. 色谱柱的选择：原料药生产对产品的纯度和杂质含量的要求非常苛刻，因此需要选择具有较高理论塔板数的色谱柱，以提供更好的分离度。
3. 流动相的选择：流动相pH、有机溶剂等是影响选择性的重要因素，需要进行筛选。
4. 检测波长的选择：在确定了目标化合物的吸收波长后，还需要进一步调整以获得最佳的峰形和分离效果。
5. 梯度的优化：除了固定波长外，还可以考虑使用梯度洗脱来进一步提高分离效果。
6. 方法验证：在确定了最佳的色谱条件后，还需要进行方法验证，确保所选的条件能够稳定、可靠地运行。
总的来说，液相方法的开发是一个系统性的过程，需要结合理论知识和实践经验，通过不断的试验和优化来确定最佳的色谱条件。
液相色谱柱的选择和方法开发
液相色谱柱的选择和方法开发液相色谱（HPLC）是一种高效、准确和灵敏的分离和分析技术，在许多领域中具有广泛的应用。
液相色谱柱的选择和方法开发是HPLC分析中的关键步骤之一，它们直接影响到分离效果和分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍液相色谱柱的选择和方法开发的相关内容，并提供一些建议和注意事项。
一、液相色谱柱的选择1.分子排阻柱（SEC）：适用于分离和分析高分子物质，如蛋白质、多肽、聚合物等。
根据目标物分子量的大小选择不同的分子排阻柱。
2.反相柱（RP）：适用于分离和分析非极性、低极性化合物。
常用的反相柱有C18、C8、C4等，根据目标物的亲疏水性选择不同的柱材和碳链长度。
3.离子交换柱（IEC）：适用于分离和分析离子化合物，如酸、碱、金属离子等。
根据目标物的离子性质选择阴离子交换柱或阳离子交换柱。
4.亲合性柱：适用于分离和分析具有特定亲和性的目标物，如抗体、酶、细胞等。
常用的亲合性柱有亲和色谱柱、亲和半制备色谱柱等。
二、方法开发方法开发是指在具体的分析目标下，通过调整柱材、流动相、柱温、检测器等参数，寻找出最佳的分离条件和分析方法。
方法开发的过程中，需要进行实验设计、参数调整和结果评估等步骤。
1.实验设计：按照试验的目的和要求，设计合理的实验方案。
包括选择柱材、柱尺寸、流动相、梯度条件、柱温等参数，并确定荧光标准品的浓度和检测波长。
2.参数调整：根据实验设计，逐步调整各种参数，寻找出最佳的分离效果。
需要注意的是，在参数调整的过程中，要逐步变化，避免一次性调整多个参数。
3.结果评估：通过比较不同条件下的分离效果和结果，评估方法的可行性和可靠性。
主要评估指标包括分离度、保留时间、峰形等。
注意事项：1.根据样品的性质和分析目标选择合适的柱材和柱尺寸。
不同的柱材和柱尺寸对分离效果和分析结果有直接影响。
2.合理选择流动相和梯度条件。
流动相的选择应考虑样品的亲疏水性质，梯度条件应选择合理的温度和时间。
HPLC培训教程
HPLC培训教程HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种高效液相色谱技术，被广泛应用于化学、生物化学、药学等领域中的分析和纯化过程。
HPLC培训教程旨在向初学者介绍HPLC的原理、仪器组成、样品制备、方法开发以及常见问题解决等方面的知识。
一、HPLC原理HPLC是一种基于色谱原理的分析方法，通过在固定填充物（固定相）上进行流动相（液相）与样品之间的相互作用，实现对样品的分离和定量分析。
其主要原理包括分配作用、吸附作用和离子交换作用。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由流动相系统、分离柱、检测器和数据处理系统组成。
流动相系统包括溶剂供应部分和混合部分，用于供给流动相。
分离柱是药物分离的关键，通常由填料柱和色谱柱两部分组成。
检测器用于检测分离柱出口的组分，并生成相应的信号。
数据处理系统将检测器信号转化为可读取的结果。
三、样品制备样品制备是HPLC分析的关键步骤，正确的样品制备可以确保分离柱正常工作并获得准确的结果。
常见的样品制备包括溶解、过滤、稀释和净化等。
溶解样品时要选择适当的溶剂，并根据样品性质进行必要的处理。
过滤可以去除杂质颗粒和减少背景噪声。
稀释可以使样品浓度适合分析要求。
净化可以去除干扰物，保证仪器的稳定性和分析结果的准确性。
四、方法开发HPLC方法开发是为了针对特定的分析目标选择适当的仪器参数和操作条件。
方法开发的关键是选择分离柱和优化流动相组成与流速，以获得较好的分离效果和分析结果。
在方法开发过程中，应该考虑分析目标、样品矩阵、仪器性能以及分析时间等因素，进行试错实验，根据实验结果进行参数调整，直到得到满意的分析方法。
五、常见问题解决在HPLC分析过程中，常常会遇到一些问题，需要及时解决。
常见问题包括峰形异常、峰分离不佳、信号漂移、背景噪声等。
为了解决这些问题，需要对仪器进行校准和维护，检查和修复分离柱，优化操作条件等。
此外，还可以通过尝试不同的分析方法或更换试剂等方法进行排除。
HPLC_方法开发
HPLC_方法开发HPLC（High Performance Liquid Chromatography）是一种广泛应用于分析领域的色谱技术，其具有快速、高效、灵敏、精确、重复性好等特点。
在HPLC方法开发过程中，需要考虑样品的物理性质、化学性质、目标分析物的特性以及后续分析的要求等因素。
首先，在HPLC方法开发的初期，需要对样品进行初步的理解和调查。
这包括确定目标分析物的性质和目标浓度范围，了解样品中可能存在的干扰物和杂质，分析样品的溶解度和稳定性等。
这些信息的获得可以通过文献调研、产品说明书、预实验等方法来进行。
接下来，选择合适的色谱柱和移动相是HPLC方法开发中的重要步骤。
色谱柱的选择主要考虑目标分析物的物理化学性质，如极性、分子量、官能团等。
根据需要可以选择反相、离子交换、凝胶渗透等不同类型的色谱柱。
移动相的选择则要考虑到目标分析物和干扰物在移动相中的溶解度和保留时间，以及保留度和分离度的平衡。
通常会进行试错法来优化移动相的配比。
优化流速和梯度程序是HPLC方法开发中的另一个关键步骤。
流速的选择需要平衡分析时间和分离度之间的关系。
流速较快可以缩短分析时间，但会降低分离度，而流速较慢可以提高分离度，但会延长分析时间。
梯度程序的优化则是为了在尽可能短的时间内同时实现目标分析物的分离和扫描。
检测器的选择也是HPLC方法开发过程中需要考虑的因素之一、常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
检测器的选择要考虑目标分析物的特性以及对灵敏度和选择性的需求。
在方法开发的过程中，还需要进行一系列的验证实验，包括系统峰形度、重复性、线性范围、检测限、定量限等方面的验证。
这些验证实验能够评估方法的可靠性和准确性，为后续的样品分析提供可靠的依据。
最后，在方法开发完成后，需要进行合适的样品前处理和样品制备方法的优化。
样品前处理步骤可以包括溶解、提取、过滤、稀释等。
样品制备方法的优化则是为了提高样品中目标分析物的得率和纯度。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
hplc 方法开发流程
hplc 方法开发流程HPLC方法开发流程HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析方法，广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。
开发一个有效的HPLC方法是保证分析准确性和可靠性的关键步骤。
本文将介绍HPLC方法开发的基本流程。
第一步是确定分析目标。
在开发HPLC方法之前，需要明确要分析的目标物是什么。
这可能是一种药物成分、环境中的某种化合物或食品中的营养成分等。
确定目标物的性质和特征对于后续的方法开发至关重要。
第二步是选择适当的色谱柱。
根据目标物的性质，选择合适的色谱柱是至关重要的。
常见的色谱柱有反相柱、正相柱、离子交换柱等。
选择合适的色谱柱可以提高分离效果和分析速度。
第三步是优化流动相。
流动相的组成对于HPLC分离的效果有很大影响。
在这一步中，需要选择合适的溶剂和添加剂，并优化它们的浓度和比例。
同时，还要考虑流动相的pH值，以保证分析目标物在色谱柱上有良好的保留和分离效果。
第四步是确定最佳的进样条件。
进样是样品在HPLC中进行分析的重要步骤。
确定最佳的进样条件可以提高分析的准确性和灵敏度。
在这一步中，需要考虑进样体积、进样方式和进样速度等因素。
第五步是优化检测条件。
检测器是HPLC中的关键设备，能够提供分析目标物的信号。
在这一步中，需要优化检测器的参数，如波长、灵敏度和线性范围等。
同时，还需要选择合适的检测器类型，如紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
第六步是验证方法的准确性和可靠性。
在开发HPLC方法之后，需要对其进行验证。
验证方法包括评估方法的线性范围、灵敏度、精密度和准确度等。
通过验证可以确保方法的可靠性和可重复性。
最后一步是编写分析方法报告。
在完成HPLC方法开发和验证后，需要撰写详细的分析方法报告。
报告应包括分析目标、色谱条件、进样条件、检测条件以及方法的准确性和可靠性验证结果。
报告的编写应遵循科学的逻辑和规范，以便他人能够复制和验证该方法。
总结起来，HPLC方法开发流程包括确定分析目标、选择适当的色谱柱、优化流动相、确定最佳的进样条件、优化检测条件、验证方法的准确性和可靠性以及编写分析方法报告。
高效液相色谱实验步骤和方法开发
食品添加剂
✓ 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 ✓ 抗氧化剂、防腐剂 ✓ 颜料和染料（色素〕 ✓ 维生素
污染物
✓ 霉菌（黄曲霉毒素〕 ✓ 农药残留和兽药残留 ✓ 多环芳烃（PAHS〕和亚硝酸
HPLC的应用领域
➢ 在医药研究中分析应用
--多数公司售出的检测器中75%以上是吸 光度检测器（其中50%以上是紫外/可见检 测器，25%是PDA）
光电二极管矩阵（Photo Diode Array）
Photo Diode Array 简称：PDA或DAD
光电二极管矩阵检测器（ PDA ）的特点和用途
➢ 一种三维水平的吸光度检测器--采集三维谱图 ➢ 兼顾紫外检测器及可见分光光度计的信息
✓ 通过改变流动相的pH值，使样品成中性
✓ 加入“对离子”，使样品呈中性 请 记 住 ∶ 调节柱长度改变柱效及分离速度 每 次 改 变 一 个 参 数
反相色谱的方法开发
开发过程实例
色谱条件∶
✓ 色谱柱：C18，4.6mm×15mm ✓ 流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）
举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 ✓ 流速：1ml/min
用于HPLC的检测器
没有任何一种单独的检测器可以适应所有的液相 色谱分离！
HPLC检测器可以分为： 溶质性质检测器（选择型） 对溶质的物理或化学性质响应，一般不反应流 动相的变化（选择型） 整体性质检测器（通用型） 不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变 化作出响应（通用型）
理想的HPLC检测器
分离(制备)时要了解哪方面的情况？
高效液相法进行含量测定的实施计划
高效液相法进行含量测定的实施计划
目标：建立并验证高效液相色谱法（HPLC）用于测定样品中特定成分含量的分析方法。
步骤：
1. 方法开发
选择合适的流动相、色谱柱和检测波长。
优化色谱分离条件，包括流速、梯度洗脱和柱温。
2. 方法验证
线性度：绘制已知浓度样品的峰面积与浓度的关系图，评估方法的线性范围。
精密度：重复分析相同样品，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。
准确度：分析已知浓度的样品，计算测定值与真实值的偏差。
选择性：评估方法是否能区分目标成分和样品中的其他成分。
稳定性：在不同的时间点分析同一批样品，评估方法的稳定性。
3. 样品制备
根据样品基质，选择合适的样品前处理方法，如萃取、过滤或衍生化。
优化样品制备条件，以最大程度地提取目标成分并减少基质干扰。
4. 仪器校准
使用已知浓度的标准溶液校准HPLC系统。
定期验证校准曲线，以确保方法的准确性。
5. 样品分析
根据验证后的方法，分析样品并计算目标成分的含量。
使用适当的定量方法，如峰面积法或外标法。
6. 数据分析
处理HPLC数据，包括峰积分、定量计算和统计分析。
根据验证结果，评估分析结果的可靠性和有效性。
7. 报告
生成分析报告，包括样品信息、分析条件、结果和任何相关的观察结果。
报告应符合相关法规和指南。
持续改进
定期审查和更新方法，以提高性能和适应新的发现。
接受持续的培训，以保持对HPLC技术的最新了解。
液相色谱的方法开发分离机理及色谱柱
有非常不同的选择性 柱效及韧性比相应的硅胶柱低 色谱机理不太清楚 文献背景低，用户少
选HPLC参数时的基本考虑
溶解度 - 选择流动相的条件 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何? 样品的基质 - 考虑如何前处理 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? 找出样品中不同组份之间的差异
摸索条件的重要线索
寿命，柱效，速度，溶剂消耗
对HPLC柱的了解
平均颗粒度，颗粒度分布
颗粒度(dp)
颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差)
颗粒分布
颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)
颗粒形状
球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀
流动相线性速度不均匀 谱带扩展
对HPLC柱的了解（二）
聚合物填料
pH：2-12 pH值小于2时 键合相水解
硅胶的溶解曲线
123456789 pH
Waters各种硅胶基质的色谱柱
C1 C4 C6 C8 C18 Phenyl CN NH2
mBandaPak
✓
✓ ✓✓
Resolve
✓✓
✓
Nova-Pak
✓✓
✓ ✓✓
Delta-Pak
✓
✓
Symmetry
✓✓
高纯度硅胶：Fe，Al，Mg等均<10ppm 孔径100A，5m球形颗粒，端基封口 超高含碳量：C18/19%，C8/12% 表面积：300 m2/g 孔体积：1mL/g 特点
好峰形，好重现性，不同的选择性，使用寿命长
Waters聚合物基质的反相柱
HPLC原理及方法简介
附录---HPLC原理及方法简介I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150-300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1-10.0 mL/min。
高效——可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01 ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
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的分析方法 查文献和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-- 仪器制造商的文献，如Dionex,Waters
对色谱柱有足够的了解
掌握分离机理，自己开发方法
充分了解您自己的样品
分析时要了解哪方面的情况？
灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?
以上因素均影响分离度
液相色谱的方法开发
梯度方法
液相色谱泵
稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合
准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成
有效的流速范围
制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑
滞后体积
梯度分析更为关注
目的：在任何情况下保持最高精度
梯度的洗脱方式
高压梯度及低压梯度
梯度平衡时间的影响（一）
10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复
梯度平衡时间的影响（二）
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟
平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的 变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化 不大因而大于这个时间时，平衡充足。
O
生物技术及制药
O O CH3 O
O
CH3
CH3
黄曲霉毒素
氨基甲酸酯类杀虫剂
光电二极管矩阵（PHOTO DIODE ARRAY）
Photo Diode Array
简称：PDA或DAD
PDA检测器 － 特点
三维水平的吸光度检测器
0.032 0.030
4.310 6.448
0.015
0.028 0.026 0.024
改变流速
5%/min 1 ml/min -> 5%/ml
5%/min 2.5 ml/min -> 2%/ml
0 2 4 6 8 T im e ( m in ) 10 12 14
结论
充分用已知样品结构确定以哪种方法开始
普通反相?
离子抑制? 离子对? 还是其他
观察流动相条件改变时色谱峰的移动
背景吸收的影响
吸光度
理想
2
1
实际
1
0
背景吸收降低 了线性范围
背景吸收
0
多数流动相有 紫外吸收
浓度
荧光（FLUORESCENCE）检测
发荧光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子 达到激发态，其返回到基态时发射光的现象即 振动能（2） 激发态 荧光 S1
基态
激发 （1） S0
发射 （3）
1. 分子在吸收UV或可见光后进入激发态，分子达到不稳定的高能 量状态。 2. 电子失去过剩的能量成为振动能，并达到最低的激发单重态。 3. 电子失去能量达到基态时发出荧光
液相色谱的检测器
常规检测器
示差折光检测器（Refractive
Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors）
液相色谱的方法开发
方法开发的过程
1. 得到样品信息，确定分离目标 2. 确定特定HPLC过程、样品预处理等的需求 3. 选择合适的检测器 4. 选择HPLC方法；初步分离；建立最佳分离条件 5. 优化分离条件 6. 检查特定过程的问题及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的确认
第一步干什么?
想办法得到各种信息
分析速度 溶剂损耗
色谱柱寿命
效率
不管是否有溶质，对流动相任何物理性质的变化
作出响应（通用型）
不同种类的检测器的分类
紫外/可见光检测器 荧光检测器 固定波长 可变波长
溶质性质 -选择型
电化学检测器
放射化学检测器 氮/硫检测器 质谱检测器 示差折光检测器
光电二极管矩阵
整体性质 -通用型
蒸发光散射检测器
电导检测器
理想的HPLC检测器
① THF / H 2O ＝ 28 : 72 ② MeOH / H 2O ＝ 58 : 42
改变色谱柱
③ CH 3CN / H 2O ＝ 38 : 62
方法开发的其他因素
流速对柱效的影响
不同内径的色谱柱有自己的最佳流速
样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响
剂
A
泵
溶剂 A 比例阀 A
混合 混合器
（溶剂混合 溶剂 B 泵 泵 B 溶剂 B
AB 低 高压梯度来自梯度：高压混合
高压梯度
使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积
梯度：低压混合
低压梯度
用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积
如设计不当，梯度的 准确性受影响
滞后体积（系统
体积）设计合理
梯度洗脱的特点
优点
单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高
缺点
仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低？
一般流出问题
早流出峰的分离度差. 迟流出峰的峰宽增加而峰高降低. 由于k’范围宽，所以分析时间长. 强保留组分造成柱污染.
样品：
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)
1.改变容量因子 K’
谱图
①
① ① 4 0 / 6 0
5 0 / 5 0 ②
③
②② ③ ③
6 0 / 4 0
2.改变分离因子Α
通过改变流动相改变α，同样强度的不同溶剂
高端检测器
光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass
Spectrometry）
示差折光（REFRACTIVE INDEX）检测
示差折光检测器（RI）是第一个商品化的液相 色谱检测器（上世纪六十年代末、七十年代初）
通常被认为是一种通用检测器 检测溶液中所有被溶解的溶质
245.6
在整个UV-Vis带 宽上检测吸光度
283.5
240.9
0.004
0.002 0.000 200.00 220.00 240.00 260.00 nm 280.00 300.00 320.00
都需要相应的软 件进行数据的分 析
方法开发一般的具体步骤
先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k’ 值改变保留值 调节a值改变选择性
共轭及芳香族化合物最容易有荧光现象
荧光检测器原理
荧光检测器的应用
环境中的污染物
多环芳烃(PAH)，
多酚，氨基甲酸酯 等
多环芳烃（PAH）
H3C CH3 CH3 CH3
食品、饮料
食品中的毒素；例
OH
如：黄曲霉毒素 染料 维生素及衍生氨基 酸
CH3
维生素
O
O H3C NH O
O
通用检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 选择性检测器 灵敏度 线性范围 流速敏感 温度敏感 破坏性 RI ug 104 是 是 否 ABS ng 105 否 否 否 ELSD ng 否 否 否 是 FL pg 103 否 否 否 MS pg 103 是 否 是 EC fg 106 是 是 是 Cond pg 105 是 是 否 MS pg 103 是 是 是
更好的色谱峰确认 更好的定量 更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
选择液相色谱的检测器
要考虑的因素： 你要分离的化合物/样品的化学特性
化学结构、分子量及紫外光谱等等
流动相的影响（溶剂、缓冲盐改性剂等） 梯度还是等度 灵敏度需求 是否有双检测的需求
选择液相色谱的检测器
－ 非特异性
任何光学介质的折光率都被定义为光在该介质 中与真空中的速度之比值
S R
吸光度（ABSORBANCE UV/VIS）检测
目前实验室中最流行的选择
多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中
50%是多波长，25%是PDA）
测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应
对压力、温度及流速等变化不敏感
长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度：信噪比
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪 音的比值（S/N） 6:1 检测限（LOD）：S/N = 3 定量限（LOQ）：S/N = 10 S 好的信噪比有利于：
AU
0.010
0.005
0.000
0.022 0.020 0.018 AU 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006
二极管矩阵检测 器是在1982年首 度出现的
7.00
2.00
2.193
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