叶绿素a测定
实验三 富营养化湖中藻量的测定（叶绿素 a 法） 、实验目的
富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中
10微克 /升。
本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素 a 浓度，以考查其富营 养化情况。 二、器材与用品
分光光度计（波长选择大于 750nm ，精度为0.5— 2nm ）。
蔡氏滤器；滤膜（ 0.45 微克，直径 47mm ）。
的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素
a 浓度常大于
1、 2、 比色杯（ 1cm ； 4cm ）。 3、 台式离心机（ 3500r/min ）
4、 离心管（ 15ml 具刻度和塞子） ；冰箱
5、 匀浆器或小研钵。
6、 7、 真空泵（最大压力不超过 300kpa ）。
MgC03悬液：Ig MgC03细粉悬于100ml 蒸馏水中。 90％的丙酮溶液： 90 份丙酮＋ 10 份蒸馏水。
10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各 2L.
三、方法和步骤
8、 9、
1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml ,池塘
300ml 。采样点及采水时间同“浮游植物” 2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤
剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素
a 分解。
3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取 500ml 减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入 0.2ml MgCO 3
悬液、摇匀直至抽干水样。加入 MgCO 3 可增进藻细胞滞留在滤 膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素 a 被分解。如过滤后的 载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷
（4C ）暗处保存，放置时间最多不能超过 48小时。
4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加 2 - 3ml90 %的丙 酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻 度离心管中，用 5ml90%丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加 90%丙酮，使管内总体积为
10ml 。塞紧塞子并在管子外部罩上
遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取 18－24小时。
离心10min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管 中，塞上塞子，3500r/min 在离心10min 。正确记录提取液的体 积。
6、测定光 密度：藻 类叶绿素 a 具有其 独特的吸 收光谱 (663nm )，因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取 液移入 1cm 比色杯中，以 90％的丙酮溶液作为空白，分别在 750、663、645、630nm 波长下测提取液的光密度值( OD )。注 意：样品提取的 O D 663值要求在 0.2与 1.0 之间，如不在此范围
50－ 5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上 3500r/min ，
内，应调换比色杯，或改变过滤水样量。OD663小于0.2时，应
该用较宽的比色杯或增加水样量；OD663大于1.0时，可稀释提
取液或减少水样滤过量，使用1cm 比色杯比色。
7、叶绿素a浓度计算：将样品提取液在663、645、630nm波长
下的光密度值( OD663 OD645 O D 630)分别减去在750nm 下的光密度值( OD750) ,，此值为非选择性本底物光吸收校正值。叶绿
素 a 浓度计算公式如下：
(1)样品提取液中的叶绿素a浓度Ca为:
Ca(微克/升)=11.64 (OD663 —OD750)—2.16 (OD645 —OD750)
+0.1(OD630－OD 750
(1) 水样中叶绿素a浓度为: 叶绿素a(微克/升)=Ca x v/(V x L)
叶绿素a(微克/升)=Ca x v/V x L
Ca:样品提取液中叶绿素a浓度（微克/升） v : 90%丙酮提取液体积（ml）
V :过滤水样的体积（L）
L :比色杯宽度（cm）四、实验报告将测定结果记录于表4-1中
表4—1测定结果
根据测定结果，参照表4-1中指标评价被测水样的富营养化程度。
表4-2湖泊富营养化的叶绿素a评价标准
五、思考题
1、比较两种水样中的叶绿素a浓度，通过本实验你的结论是什么？
2、如何保证水样叶绿素a浓度测定结果的准确性？主要应注意哪几个方面的问题?
叶绿素的提取和分离实验报告
陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心
叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 2. 叶绿体色素的分离 (1)将11cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。 (2)用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。 (3)在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。 0.5-1小时后，观察色素带分布：最上端橙黄色(胡萝卜素)，其次黄色(叶黄素)，再崐次 蓝绿素(叶绿素a)，最后是黄绿色(叶绿素b)。（4）当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实 验，此时可看到不同色素的同心圆环，各色素由内往外的顺序为：叶绿素b（黄绿色）、叶 绿素a（蓝绿色）、叶黄素（鲜黄色）、胡萝卜素（橙黄色），再用铅笔标出各种色素的位置 和名称。
叶绿素a的测量-乙醇提取法
Hydrobiologia485:191–198,2002. ?2002Kluwer Academic Publishers.Printed in the Netherlands. 191 Chlorophyll-a determination with ethanol–a critical test ′Eva P′a pista1,′Eva′Acs2&B′e la B?ddi3,? 1E?tv?s Lor′a nd University of Science,Doctoral School,P′a zm′a ny P′e ter allee1/A,Budapest H-1117,Hungary 2E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Microbiology,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C Budapest H-1117, Hungary 3E?tv?s Lor′a nd University of Science,Department of Plant Anatomy,P′a zm′a ny P′e ter allee1/C,Budapest H-1117,Hungary Tel:12660240;E-mail:bbfotos@ludens.elte.hu (?Author for correspondence) Received2May2001;in revised form30August2002;accepted20August2002 Key words:algae,chlorophyll-a determination,ethanol,ISO standard10260(1992) Abstract Chlorophyll-a content is widely used as an indicator of the quality of freshwater bodies.Quanti?cation of chlorophyll-a is a routine procedure in the test laboratories of water works,and in research laboratories.Although attempts have been made to standardise the measurement procedure,there are nonetheless many procedures currently in use.This work is focused on a careful re-examination of the ISO:10260,1992standard,which prescribes90%(v/v)ethanol for chlorophyll extraction and measurement.Chlorophyll contents of cultures of the cyanobacterium Synechococcus elongatus N?geli and the chlorophyte Scenedesmus acutus Meyen were determined by means of a series of concentrations of ethanol/water mixtures which were employed as extracting agents–the water content was gradually decreased from20to0%.The extraction procedure was veri?ed by measuring the amount of retained water after using both water and oil pumps for?ltering the samples.The spectroscopic effects of the presence of water were studied and the molecular background of these spectral phenomena is discussed.The extraction yields obtained with90%ethanol were compared to those obtained with methanol and acetone.On the basis of the calculated error level,improvements to the ISO:10260,1992standard method have been suggested. Introduction The chlorophyll(Chl)content of freshwater bodies is a widely accepted indicator of water quality.Research projects on periphyton(Cattaneo,1983;Jonsson, 1987;Robinson&Rushforth,1987;Pantecost,1991) or phytoplankton(Kiss&Genkal,1993;Balogh et al., 1995;Jones,1995;Kiss,1996;Sha?k et al.,1997; Skidmore et al.,1998;Kiss et al.,1998)use these characteristics to describe the trophic state(Sumner &Fisher,1979;V?r?s&Padisák,1991;Talling, 1993)of the studied system.However,the identi?c-ation of the alga species,the knowledge of the algal cell number,or the physiological state of cells may also be important in providing a true picture of the water quality or trophic state.A combination of Chl determination and consideration of these other factors may provide an improvement in the reliability and ac-curacy of water quality estimation.Uterm?hl(1958) developed a method to determine the individual num-ber of algae with an inverted microscope and Lund et al.(1958)described a procedure to estimate the accuracy and limitations of Uterm?hl’s method. If certain taxa are in developing or degrading stages in the studied populations,consideration of the factors above is essential,since certain species produce toxins harmful to both water animals and hu-man(Slatkin et al.,1983;Codd et al.,1992).It has been established that the presence of algae and thus the Chl content indicate the concentration of certain chemicals or the appearance of toxins in the drinking water(Bernhardt&Clasen,1991).Thus,considera-
YSI(多参数水质检测仪)测定叶绿素a浓度的准确性及误差探讨解析
上肠ｋｓｄ．（湖泊科学），２０１０，２２（６）：９６５－９６８ ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｊｌａｋｅｓ．ｏｒｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｈｋ∞＠ＩｌｉｇＩａｓ．ａｃ．ｃｎ ＠２０ｌＯｂｙ如￡册耐矿ｋｋｓｃ泐鲫 ＹＳＩ（多参数水质检测仪）测定叶绿素ａ浓度的准确性及误差探讨‘刘苑１”，陈宇炜Ｈ。，邓建明１’２ （１：中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京２１０００８） （２：中国科学院研究生院，北京ｌｏ００４９） 摘要：Ｙｓｌ（多参数水质检测仪）由于其快速、轻便的特点，已广泛应用于野外水体中时绿素ａ的测定．通过将Ｙ跚溯得的叶绿素ａ值与分光光度法测定值进行比较，对Ｙｓｌ６６００水质测定的准确性和数据采集进行评估．结果显示，Ｙｓｌ测定值多数偏低。且与分光光度法测定值之间存在显著性差异；时间上，冬季比夏季具有更大的线性相关性．分段同归结果显示，随着叶绿素ａ浓度不断增大．两组数据的差值也不断增大．ＹｓＩ测定误差产生于３个方面：（１）测定前ＹｓＩ校准方法的不同；（２）其它种类具有荧光特性色素的存在；（３）ＹｓＩ自身结构． 关键词：叶绿素ａ浓度；ＹＳＩ；分光光度法；误差 ＤｉｓＣｕｓｓｉＯｎ０ｎａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｅｒｒＯｒＳｆｏｒｐｈｙｔｏｐＩａｎＩ∞ｎｃｈｌｏｒｏｐｈｙ¨－ａｃｏｎｃｅｎｔｒａ埘０ｎａｎａＩｙＳｉＳｕｓｉｎｇＹＳｌ（ＭｕＩｔＩ－ｐａｒａｍｅｔｅｒｗａｔｅｒａｎａｌｙｚｅｒ） Ｕ［ＵＹｕ觚１ｒ，Ｃ胍ＮＹｈｗｅｉｌ＆ＤＥＮＧＪｉ柚ｍｉｎ９１．２ 巧ｓｃｉｅ，ｌｃｅｓ．Ｎｎ嘲ｉ他２、０００ｓ．Ｐ．Ｒｃｈｔ舱）（１：胁把研ｋ幻加ｆｏ秽巧上４妇＆妇懈４耐勖佃研珊跏ｆ，觑ｌ咖ｇ肺咄姚可＆珊，印砂研ｄ肠彻咖，劭加甜ＰＡｃ扭娜（２：Ｇ，眦妇纪＆幻Ｄｚ盯ｃＪ咖ｅ卵Ａ棚ｄ唧矿＆￡伽，＆驴ｆ，增ｌ（－Ｄ０４９，Ｐ．尼西ｆ，埘） Ａｂｓｔ陀ｃｔ：ＹｓＩ（Ｍｌｌｌｔｉ?ｐａ强ｌｎ曲盱ｗａｌｅｒ锄ａｌｙ蹭ｒ）ｉｓ诵ｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏ山把皿ｉ肿ｐｈｙｔｌＤｍ锄ｋｔｏｎ ６ｅＩｄｓｃｈｌ啪ｐｈｙｌｌ－ａｃｏｎｃｅｎｔｒ撕加ｉｎｍ蛐ｙｂｅｃ舢卵０ｆｉｔｓｒａｐｉｄｎｅ睇锄ｄｐｏｒｔａｂｌｅｎｅ鹄．Ｔｂｅｐｕ叩∞ｅ０ｆｔｌｌｉｓ咖由ｉ８ｔ０ｅｖａｌｕ砒ｅｔＩｌｅｅ伍ｃ卵ｙ０ｆｔ王ｌｅＹＳＩＥｎ“姒蛐ｅｎｔａｌＭｏ＿Ｉｌｉ试ｎｇｓｙｅ锄ｈｗ栅ｑＩｌａｌｉｔｙⅡ地ａ棚他眦“ｔｓａｎｄｄａｌａｃｏｕｅｃｔｉｏｎｂｙｃｏｍｐｆａｒｉＩｔｇｔｗ０ｇｒｏｕｐ邑０ｆｄａｌａ憾ｉｌｌｇ蚰啪ｌｔｏｒｙ耐｝
叶绿素a测定实验报告
叶绿素a测定实验报告 （一）实验目的及意义 水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。 （二）水样的采集与保存 1.确定具体采样点的位置 2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍 3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L 4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL 5.将采样瓶拧上并编号 6.用GPS同步定位采样点的位置 （三）仪器及试剂 仪器： 1.分光光度计 2.比色池：10mm 3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm） 4.研钵 5.常用实验设备 试剂： 1.碳酸镁悬浮液：1%。称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。每次使用时要充分摇匀 2.乙醇溶液 （四）实验原理 将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。 将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。 （五）实验步骤 1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。 2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。 3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。 4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。
植物叶绿素测定方法
叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645
叶绿素a的测定(B)
叶绿素a的测定(B) 叶绿素是植物光合作用中的重要光和色素。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体的初级生产力情况。在环境监测中，可将叶绿素a含量作为湖泊富营养化的指标之一。 1.水样的采集与保存 可根据工作的需要进行分层采样或混合采样。湖泊，水库采样500ml，池塘300ml，采样量视浮游植物的分布量而定，若浮游植物数量较少，也可采样1000ml。采样点及采样时间同“浮游植物”。 水样采集后应放置在阴凉处，避免日光直射。最好立即进行测定的预处理，如需经过一段时间（4～48h）方可进行预处理，则应将水样保存在低温（0～4℃）避光处。在每升水样中加入1%碳酸镁悬浊液1ml，以防止酸化引起色素溶解。水样在冰冻情况下（-20℃）最长可保存30d。 2.仪器设备 （1）分光光度计 （2）真空泵 （3）离心机 （4）乙酸纤维滤膜（孔径0.45um） （5）抽滤器 （6）组织研磨器或其他细胞破碎器 （7）碳酸镁粉末 （8）90%丙酮
3.试验程序 (1)以离心或过滤浓缩水样，在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜。倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大（约为50kpa）。水样抽完后，继续抽1～2min，以减少滤膜上的水分。如需短时期保存1～2d时，可放入普通冰箱冷冻，如需长期保存（30d），则应放入低温冰箱（-20℃）保存。 (2)取出带有浮游植物的滤膜，在冰箱内低温干燥6～8h后放入组织研磨器中，加入少量碳酸镁粉末及2～3ml90%的丙酮，充分研磨，提取液绿色a。用离心机（3000～4000r/min）离心10min。将上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。 (3)再用2～3ml的90%的丙酮，继续研磨提取，离心10min，并将上清液再转入容量瓶中。重复1～2次，用90%的丙酮定容为5ml或10ml，摇匀。 (4)将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%的丙酮做空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。 4.计算方法 叶绿素a的含量按如下公式计算 [11.64×(D663-D750)—2.16×（D645-D750）+0.10×（D630-D750）].V1叶绿素a（mg/m3）= ----------——-—————————————-----------------------———V.δ 式中：V——水样体积（L） D——吸光度 V1——提取液定容后的体积（ml） δ——比色皿光程（cm）
2-4叶绿素a测定
实验题目: 湖塘水体叶绿素a测定 姓名：学号： 班级：组别：第一组 指导教师： 1.实验概述 1.1实验目的及要求 (1)初步了解叶绿素a测定的原理和常规测定方法; (2)通过实验，掌握叶绿素。的测定方法及富营养化水样的前处理方法; (3)熟练掌握抽滤装置及分光光度计的使用。 1.2实验原理 浮游植物的主要光合色素是叶绿素((Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b和c。叶绿素a (chl-a >存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1-2%，是估算浮游植物生物量的重要指标，因此浮游植物叶绿素a含量的测定成为浮游植物生物量的重要指标而被广泛应用。 浮游植物叶绿素a的测定方法有许多种，根据所使用的仪器可以分为高效液相色谱法 萃取效率比较低，使得甲醇和乙醇成为替代丙酮的色素萃取剂。不过，甲醇对人体毒害性大，且在酸化过程中容易产生误差，于是，乙醇成为现在广泛应用的叶绿素a的萃取剂。超声破碎法因快速、提取效率高等特点也被研究者所青睐。 本实验介绍一种以热乙醇为萃取溶剂，结合超声细胞破碎法为基础的叶绿素a含量侧定方法。 2.实验内容 2.1实验方案设计 每组选择一个池塘，实地取水样，测定水样的叶绿素a含量。 2.2实验条件 2.2.1实验仪器: 1) 幼分光光度计1台; 2)抽滤装置(砂芯过滤器、负压表、真空泵等)1台; 3)4000r/min离心机1台; 4) 15mL带刻度及螺旋盖的离心分离试管6个; 5)恒温水浴锅1台; 6)直径47 mm的醋酸纤维滤膜; 8)超声细胞破碎仪 9 ) icm玻璃比色皿2个 10)表面皿若干 11)10mL比色管7个; 2.2.2实验材料 1）90%乙醇 2）1mol/L盐酸 2.3实验过程（实验步骤、记录、数据、分析） 2.3.1实验步骤 叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。 解方程（1） （2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7) 叶绿体色素实验报告 ●实验名称 叶绿体色素的提取分离和理化性质测定 ●实验原理 叶绿体是光合作用的细胞器。叶绿体中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素可以溶解于乙醇等有机溶剂提取。 薄纸层析色谱法是将吸附剂均匀涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把带分离的样品溶液点在薄层板下端，然后用一定量溶剂作流动相，将薄层板下端浸入展开剂中。由于吸附剂对不同物质的吸附能力不同，吸附力强的物质相对移得慢些，吸附力弱的物质相对移得快些，从而使各组分有不同的移动速度而分开。 叶绿素是一种由叶绿酸和叶绿酯形成的复杂酯，故可以与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿酯及叶绿酸盐，盐可溶于水，继而可以分离叶绿素和类胡萝卜素。叶绿素吸收光子转变为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当变回基态时可发出红光量子，产生荧光。叶绿体不稳定，容易受强光破坏，特别是当叶绿体与蛋白质分离后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中Mg2+可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，之后遇铜生成铜代叶绿素。 ●实验材料和工具 1.新鲜的菠菜叶 2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7：5：1，体积比） 3.天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸 4.刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管 5.苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸—醋酸铜溶液，氢氧化钾—甲醇溶液 ●实验步骤 （一）色素提取液的制备 1.取新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中 2.研钵中加入少量CaCO3，加2~3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml 体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液，避免阳光直射 （二）叶绿色素的分离 1.取硅胶板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行与硅胶板短边，据下边缘1cm处划线，风干后再划3~4次 2.干净的层析缸中加适量展开剂，高度约0.5cm，将硅胶板有色素一端放入，使其下端浸入展开剂。迅速盖好 当各种色素得到较好分离时，展开剂前沿接近硅胶板上边缘时，取出并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带位置 （三）理化性质的测定 ①光对叶绿色素的破坏 取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数95%的乙醇稀释1倍。其中1支放在直射阳光下，另外1支放到暗处或用锡箔纸包严，40分钟后对比观察颜色变化 ②皂化作用 1.取1支10ml刻度试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾—甲醇溶液，充分摇匀 2.片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀，然后置于试管架上静置分层。 ③H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg+的取代作用 1.取两支试管，第一支加叶绿色素提取液5ml作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加质量分数为5%的HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热。 2.取新鲜植物叶两片，放入试管中，加醋酸—醋酸铜溶液，使之没过叶片，60℃水浴，观察颜色 ④荧光现象的观察 取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光照射下，比较溶液透射光和反射光颜色有何不同 实验结果 提取与分离 计算方法Rf=斑点中心到原点的距离 溶液前沿至原点的距离R f（叶绿素a）=60.5/84.5=0.716 R f（叶绿素b）=56.0/84.5=0.663 R f（叶黄素）=53.5/84.5=0.633 实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75 叶绿素含量的测定 绿素含量的绿定叶 一、绿绿目的 1.了解分光光度绿的工作原理～ 2.掌握不同型分光光度绿的操作方绿～号 3.通绿本绿绿的绿掌握绿素含量绿定的一绿常绿的方法学叶------分光光度法。 二、绿绿原理 叶叶体体体叶绿素是脂溶性色素～主要存在于以绿绿首的色素中。在活中～绿绿 素脂蛋白绿合受到绿原系绿的保绿～绿和光是绿定的。与并氧 叶绿素的80%丙绿提取液在波绿663nm～645nm有吸收峰～绿素叶a和绿素叶b 的绿度符合以下公式, C=0.0127A-0.00259A a663645 C=0.0229A-0.00467A绿度绿位是,g/Lb645663 C=12.7A-2.59Aa663645 C=22.9A-4.67A绿度绿位是,mg/Lb645663 叶绿素绿绿度绿, C=C+CTab 若以绿液中色素含量表示～绿来 三、绿器、绿绿和材料 1.绿器 紫外-可绿分光光度绿、、研体25ml容量、璃漏斗、璃棒、皮绿滴管瓶玻玻2. 绿绿 丙绿;分析绿,、85%丙绿、80%丙绿 2.材料 绿绿、石英砂、酸绿碳 四、操作步绿 1. 在遮光件下取出等绿绿品～剪碎～混～取绿绿条匀称0.1-0.5g～ 2. 绿品置于绿～加入少量酸绿和石英砂～加入一定绿的丙绿磨绿绿～再加研内碳体研匀 85%丙绿适量绿绿磨至绿绿白色～研 3. 绿绿有绿绿的漏斗绿液绿入将匀25ml的容量中～用瓶并80%的丙绿分次洗绿和绿绿清研～ 最后用80%的丙绿定容。 4. 以80%的丙绿绿比液～在参663和645nm波绿绿绿定吸光绿;A绿在0.2-0.8范绿～内 绿度绿大绿用80%丙绿适稀绿,。当 五、绿果绿理 按照公式绿算出绿素叶a和绿素叶b的绿度～再绿算出绿素的含量。叶六、 注意事绿 1. 在活～绿合绿绿素是绿定的～绿绿一绿破～绿素易被光解。因此～抽提和绿体内叶坏叶 定工作绿可能避光快速完成。尽 2. 绿含有大量酸性液泡的绿品～绿首先加入微性的绿液～仔绿磨后加入丙绿绿行碱冲研抽提。 3. 分光光度绿的精度绿绿定的绿果有至绿重要的影～使用前绿绿器绿行校正。响七、思考绿 一、实验目的： 1、了解植物组织中叶绿素分布及性质。 2、掌握测定叶绿素含量的原理和方法。 3、了解紫外分光光度计的用法。 4、了解一阶导数的含义。 5、了解如何如何排除互相干扰。 二、实验原理： 叶绿体中的色素都能够溶解于有机溶剂丙酮中，所以，可以用丙酮提取叶绿体中的色素。 层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂。根据叶绿体中的四种色素在层析液中的溶解度不同来进行分离，溶解度高的在滤纸上扩散的快，溶解度低的扩散地慢。溶解度最高的是胡萝卜素，它随层析液在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；叶绿素b的溶解度最低，扩散速度最慢。这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。 叶绿素a和叶绿素b的分子结构相似，它们的吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱重叠，用常规分光光度法和荧光方法难以实现其同时测定。但利用一阶导数光谱技术和同步荧光技术，消除了叶绿素a和叶绿素b的光谱干扰，可以同时测定它们的含量。 在600~700之间胡萝卜素一阶导数为零，没有吸收，在某个特定波长下，叶绿素a有一定的导数值，而叶绿素b的导数为零；同理，在另一个特定波长下，叶绿素b有一定的导数值，而叶绿素a的导数值为零。这样可以实现叶绿素b和叶绿素b的同时测定，又不受胡萝卜素的干扰。 三、实验材料： 1、仪器 干燥的定性滤纸、烧杯（100ml）、研钵、玻璃漏斗、分液漏斗、剪刀、小试管、试剂瓶、药勺、量筒（10ml)、天平、试管架、载玻片、铅笔、 直尺、棉花、移液管、洗耳球、毛细吸管、铁架台、胶头滴管、紫外分光 光度计。 2、药品 新鲜的菠菜叶、石英砂、碱式碳酸镁、90％丙酮、层析液（石油醚：丙酮：苯=20:2:1） 四、实验方法与步骤： 1．提取叶绿素中的色素 （1）取几片绿叶，去掉主脉，用天平称取20g叶片，剪碎，放入研钵。 （2）向研钵中加入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨。用量筒量取15ml丙酮。倒入研钵中，迅速充分研磨。 （3）将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到一个小试管中，及时用棉塞将试管塞紧。 2.制备过滤纸 取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm，宽1cm的滤纸条， 叶绿素a的测定方法一一乙醇+分光光度法 1、水样的保存 水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h）,则应置于0°C?4 °C低温下保存。水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L 。 2、抽滤 在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。抽滤时负压应不大于50kPa。抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20C低温冰箱中可保存30天。 3、提取 研磨可用玻璃研钵。将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7?8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml o盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h 。 4、离心 将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500?4000rpm,离心10?15min。将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。最后将提取液定容到10ml。如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h ，取其清液即可。 5、测定 用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度 计零点）。测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A; 然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nn处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A 则提取液中叶绿素a的浓度为： Chla=27.9 x( A- A) x V是取液/V 脱镁叶绿素浓度为： Chla=27.9 x( 1.7 A 2-A) x V是取液/V 其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L ; V提取液为提取液的最终定容体积，单位为 mL; V为抽滤水样的体积，单位为L。 叶绿素的提取及叶绿素铜钠的合成及测定生物资源系食卫101 韦琪（20102023） 指导老师：张倩、刘新梅 一、实验目的 1.从蚕沙中提取叶绿素并计算提取率； 2.研究用叶绿素合成叶绿素铜钠的工艺条件； 3.分析叶绿素铜钠产品的纯度，计算产率； 4.通过试验提高综合能力及练习巩固各种相关操作。 二、实验原理 蚕沙是桑蚕的排泄物，由蚕沙制取天然色素——叶绿素酮钠盐，是国外普遍采用的最佳途径。叶绿素是一种酯，因此不溶于水，而溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。 叶绿素是植物吸收太阳能进行光合作用的主要色素，叶绿素是一种含有卟吩环的天然色素，在叶绿素的结构中，含有一个由四个吡咯环和四个次甲基交替相联形成的卟吩环．卟吩环闭合的共轭体系提供了包围镁离子(或其它相似离子)的刚性平面．高等植物中含有叶绿素a和叶绿素b分子式如下： 蚕沙中含有丰富的叶绿素，其纯含量达0.8—1.0%，居所有天然色素之首，故可用蚕沙来提取叶绿素，由于叶绿素易溶于乙醚、苯、丙酮、乙醇的脂性溶剂，故可用乙醇、丙酮混合液来提取。所得的叶绿素由于遇热、光、酸、碱等易分解，且又不溶于水。110度左右会分解，故把叶绿素制备成叶绿素铜钠，其性质更稳定溶解性也会有所提高。 叶绿素分子中的镁原子和四个吡咯上的氮原子相结合，环上是双羧酸的酯，一个被四所酯化，另一个被叶醇基所酯化，故可以发生皂化反应生成钠盐： C55H72MgN4O5 + 2 NaOH →C34H30O5N4MgNa2 + CH3OH + C20H39OH 在酸性介质中，叶绿素钠盐分子中的镁极易被氢原子取代生成褐色的叶绿素酸： C34H30O5N4MgNa2+ 4 H+→C34H34O5N4 + Mg2+ + 2 Na+ 叶绿素酸可与铜盐加热条件下生成叶绿素铜酸析出，将叶绿素铜酸溶于丙酮，再与碱反应就生成叶绿素铜钠盐： C34H34O5N4 + Cu2+→C34H34O5N4Cu + 2 H+ C34H34O5N4Cu + 2 NaOH →C34H34O5N4CuNa2 + 2 H2O 由叶绿素转化成叶绿素铜钠的过程也可用化学反应方程表示： （1）皂化： COOCH3COONa C32H30ON4Mg + 2NaOH → C32H30ON4Mg + CH3OH + C20H39OH COOC20H39 COONa （2）酸化： COONa COOH C32H30ON4Mg + 2H2SO4 → C32H30ON4H2 + MgSO4 + NaSO4 COONa COOH （3）铜代： COOH COOH C32H30ON4H2 + CuSO4 → C32H30ON4Cu + H2SO4 COOH COOH （4）成盐： COOH COONa C32H30ON4Cu + 2NaO H → C32H30ON4Cu + 2H2O COOH COONa 三、实验仪器和试剂 1.仪器：（一个），分液漏斗（2个）,250mL锥形瓶（1个），烧杯（100ml、250 mL、 500mL ）各1个，容量瓶（100mL、250mL）各1个，蒸馏装置，减 压过滤装置，玻璃棒，电子天平，圆底烧瓶（250mL）2个，酸度计， 分光光度仪（一台）。 2.试剂：（50g）、95%乙醇，丙酮，石油醚，2%～5%NaOH乙醇溶液，硫酸铜溶 实验三 富营养化湖中藻量的测定（叶绿素 a 法） 、实验目的 富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中 10微克 /升。 本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素 a 浓度，以考查其富营 养化情况。 二、器材与用品 分光光度计（波长选择大于 750nm ，精度为0.5— 2nm ）。 蔡氏滤器；滤膜（ 0.45 微克，直径 47mm ）。 的藻类旺盛生长。此类水体中代表藻类的叶绿素 a 浓度常大于 1、 2、 比色杯（ 1cm ； 4cm ）。 3、 台式离心机（ 3500r/min ） 4、 离心管（ 15ml 具刻度和塞子） ；冰箱 5、 匀浆器或小研钵。 6、 7、 真空泵（最大压力不超过 300kpa ）。 MgC03悬液：Ig MgC03细粉悬于100ml 蒸馏水中。 90％的丙酮溶液： 90 份丙酮＋ 10 份蒸馏水。 10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各 2L. 三、方法和步骤 8、 9、 1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml ,池塘 300ml 。采样点及采水时间同“浮游植物” 2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤 剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素 a 分解。 3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取 500ml 减压过滤。待水样剩余若干毫升之前加入 0.2ml MgCO 3 悬液、摇匀直至抽干水样。加入 MgCO 3 可增进藻细胞滞留在滤 膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素 a 被分解。如过滤后的 载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷 （4C ）暗处保存，放置时间最多不能超过 48小时。 4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加 2 - 3ml90 %的丙 酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。然后用移液管将匀浆液移入刻 度离心管中，用 5ml90%丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加 90%丙酮，使管内总体积为 10ml 。塞紧塞子并在管子外部罩上 遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取 18－24小时。 离心10min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管 中，塞上塞子，3500r/min 在离心10min 。正确记录提取液的体 积。 6、测定光 密度：藻 类叶绿素 a 具有其 独特的吸 收光谱 (663nm )，因此可以用分光光度法测其含量。用移液管将提取 液移入 1cm 比色杯中，以 90％的丙酮溶液作为空白，分别在 750、663、645、630nm 波长下测提取液的光密度值( OD )。注 意：样品提取的 O D 663值要求在 0.2与 1.0 之间，如不在此范围 50－ 5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上 3500r/min ，(完整word版)叶绿素含量的测定
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