20130111-全球销售培训-蛋白

a：血液尿液样品300-1000种，细胞系样品稍高一些
对于编码蛋白有上万的，需要做大量的工作才能达到>50%，对于基因 组小（如微生物，编码几千个蛋白），可达到40%。
19
定量蛋白质组学
对多个样品表达的全部 蛋白质进行定量比较， 来研究特定的生命现象
生长发育机制 育种研究 抗逆、抗病机制 ……
疾病样本 对照样本
蛋白表达 差异分析
定量蛋 白组学
差异蛋白 功能分析
目标蛋 白组学
临床免 疫学检测
候选biomarker 初筛
候选biomarker 验证
40
案例分析
Nat Biotechnol. 2011 Jun 19;29(7):635-43. doi: 10.1038/nbt.1899.
研究目标：寻找心肌梗死相关蛋白biomarkers。 研究方法： 进行label free定量； 2) 取外周血进行AIMS定量验证，缩小biomarker候选范围； 52个蛋白 3) 进一步验证：western-blot、ELASA和MRM技术。 研究成果：完整的biomarker从发现到验证的过程，验证到3个 新的biomarkers：ACLP1, FHL1 and TPM1，并证明该研究思 路的可行性。
目标蛋白分析
MRM: Multiple Reaction Monitoring
Q3
Q1 Q2
36
技术流程
样 品 检 测
37
Transition 预测
38
技术应用
技术优势

应用领域

通量高 定向性强 灵敏度高
生物标志物的验证 低丰度蛋白的研究 家族或同源蛋白的研究
39
生物标志物(biomarker)验证
PMF&数据库
质谱鉴定
一级质谱和二级质谱
基于质谱的蛋白质组学
修饰蛋白 磷酸化修饰
目标蛋白
MRM iTRAQ Lable-free
蛋白鉴定 胶点 胶条 混合物 全谱
定量蛋研究
Biomarkers，耐药性
生物进程
构建物种蛋 白质数据库
LTQ Orbitrap velos, Thermo
17
CHPP蛋白鉴定数据
5种组织样品，13个 cell lines，总共鉴定 12101个蛋白质，覆 盖了59.8%编码基因。
What indicate?
BGI数据
J PROTEOME RES. 2013, 12(1): 67-80.
蛋白鉴定数目
物种 人 IPI_human 小鼠 IPI_mouse 单篇最高鉴 文章平均蛋 定蛋白数量 白鉴定数量 7k-10k —— 2k-4ka 1k-3k
28
常见定量蛋白质组方法比较
体内标记法 方法 2-DE/ DIGE 丰度较高 的蛋白 1-2个样品 低 低 低
15
体外标记法 ICAT iTRAQ Labelfree
N标记
SILAC
样本类型
细胞、酵 母、细菌 2个 中 中 高
细胞、酵 母、细菌 2-3个 中 高 高
所有样本
所有样本
所有样本
通量 蛋白鉴定数 定量准确性 实验经费
基于质谱的蛋白质组学
罗宏敏 luohongmin@
质谱仪
QTRAP5500 Producer Source-Analyzer Resolution Accuracy Application AB Sciex ESI-Triple Q >12,000 <700ppm MRM, PTM
预期结果：针对几十种蛋白，在 千数量级的样本中进行验证，评 价候选蛋白的有效性，并缩小到 几种候选biomarker指导临床应 用。
42
• 样本来源：血浆
• 方法：基于MRM的目标蛋白定量分析
植物目标蛋白检测
Multiplexed protein quantification in maize leaves by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry: an alternative tool to immunoassays for target protein analysis in genetically engineered crops

为啥不同的胶点却鉴定到相同的蛋白1,2？
①
②
③
翻译后修饰 不同亚型 蛋白降解
b.
a. PLANTA. 2009, 230(5): 1033-46. J PROTEOME RES. 2012, 11(12): 6066-79.
胶条鉴定案例
Methoprene and temperature effects on caste differentiation and protein composition in the Formosan subterranean termite, Coptotermes formosanus Example Gel-Day 5 Rep3
iTRAQ注意事项1

不推荐组间比较——效果不好
Set 1 A1 B C A2 Set 2 D E


Set1的B与Set2的D，不推荐； 或者公共内标A1、A2，进行校正，目前统计方法还不成熟， 可靠性没有经过严格评估，不推荐


解决方法
压缩实验 用label free
iTRAQ注意事项2
凝胶定量(DIGE)
体内标记法
SILAC法
1、15N标记法
在培养基中添加 N，细胞培养
15
5-6代后蛋白质将被同位素标记
2、SILAC法
在培养基中添加同位素标记的 氨基酸，细胞培养5-6代后蛋白质将 被同位素标记
iTRAQ
简介：
iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的等重标签，通过特异性标记多肽的氨基基团， 而后进行串联质谱分析，对4种或8种样品中蛋白质进行相对定量或绝对定量
A B
A
B
确定适合的水杨酸 (SA) 浓度
揭示水杨酸提高小麦耐旱性的机制
J Proteome Res. 2012 Dec 7;11(12):6066-6079
10
常见问题

胶点鉴定失败的原因？
① ② ③ ④
蛋白质为未知蛋白→鉴定无结果 蛋白量过少→鉴定结果的评分低，可信度不高 角蛋白污染→鉴定为污染蛋白 样品本身含盐过高→鉴定结果的评分低，可信度不高
TripleTOF 5600, AB SCIEX
蛋白鉴定
胶 点
胶 条
2D-gel
2D-DIGE
SDS-PAGE
IP & Co-IP Pull-down
混 合 物
全 谱
Tissue
IP & Co-IP Pull-down Cell Protein
8
胶点
9
胶点鉴定案例
Proteomics Reveals the Effects of Salicylic Acid on Growth and Tolerance to Subsequent Drought Stress in Wheat
41
121个蛋白
1) 取3例心肌肥大病人药物处理前、中、后的心脏冠状窦血，先
蛋白biomarker研究推荐思路
• 发现阶段：潜在biomarker的鉴定 • 样本数：十数量级 • 样本来源：组织、体液、血浆、细胞系等 预期结果：鉴定到上千种蛋白， 找到百种差异蛋白
• 方法：基于2D LC-MS/MS的iTRAQ或label-free定量分析


不同物种不能同一批上机
一个物种的蛋白复杂性非常高，多个物种混合提高样品复 杂程度，增加鉴定难度 家蚕夜蛾项目，与其他家蚕项目比较
家蚕和夜蛾混合同一批上机 家蚕 夜蛾 546a 532b <532b 其他家蚕项目 >1500a >1900a

a.家蚕基因注释的蛋白数据库 b.家蚕和果蝇基因组合并注释的蛋白数据库
定出63个差异蛋白
2D gel：22个差异蛋白 iTRAQ：59个差异蛋白 1) iTRAQ通量高，一次可比较8种样品，节省时间； 2) 两种技术鉴定、定量结果互为补充； 3) iTRAQ定量结果优于2D gel；2D gel中一个胶点内含有多种蛋白，不利于定量分析； 4) iTRAQ标记技术灵敏度由于2D gel，特别是针对非常相似的样品。
2个 中 中 中
2-8个 中 高 中
多个 高 中 高
定量产品常见问题
iTRAQ注意事项
1.
iTRAQ与2D gel结果的比较
临床分离的4株结核杆菌，收集其分泌蛋白 2D gel：120 spots— 25spots iTRAQ：101和137个差异蛋白（分泌蛋白和 胞质蛋白）
人肺鳞状细胞癌biomarkers研究 癌组织细胞和正常支气管上皮细胞，共鉴

定量结果与其他技术，如western blot，Elisas会有 差异，但总体趋势应该是一致的。
Elisas定量结果
正常现象，两种定量技术不同，一个是从蛋白 层面定量，另一个是从肽段层面，而且也经过 分离。但趋势是一致的
Mol Cell Proteomics. 2011 Aug;10(8):M110.005686.doi:10.1074
J Insect Sci, 2012. 12: p. 18.
12
IP, Co-IP, Pull-Down样品
免疫沉淀：靶蛋白+抗体=沉淀 免疫共沉淀：靶蛋白X+蛋白Y+抗体=沉淀
Pull-down：捕获蛋白+诱饵蛋白+亲和树脂
13