全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室

当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
合适的pH值：PH:4.25
合适的TPPS的浓度：1.5x10-6 -1"L’
2.蛋白质的分泌：
A. 为刺激给予之前;B、C. 为刺激给予后 MIN6 细胞用吖啶橙荧光染料转染后给予50 mmol/ L 氯化钾
刺激,应用TIRFM 得到全反射影像
A1 为刺激给予之前;B、C1 为22mmol/ L 葡萄糖给予之后 MIN6 细胞应用吖啶橙荧光染料转染后给予高浓度葡萄糖刺激,
应用TIRFM 得到全反射影像。
3.全内反射荧光显微镜同原子 力显微镜结合的应用
Injected Fluorescent Beads
1) Silanization of whisker crystals 2) Modification of PC-linker
成像系统的消逝场 是通过入射光经物 镜本身全反射产生
棱镜型系统包括三个主要部分
(1) 倒置的相衬光学显微镜; (2) 可以二维精确移动的样品台; (3) 用来发生全反射的棱镜
棱பைடு நூலகம்型评价
棱镜型系统在实现上更加容易,它只
1
需要激光光源、棱镜和显微镜。
在探测上,它也不容易受到入射光信
2
号的干扰
全内反射荧光显微镜
Presented by 何维清 张帆 吴夕 姚兴荣
Contents
11..全全内内反反射射荧荧光光技技术术发发展展历历程程 22..全全内内反反射射的的基基本本原原理理 33..微微镜镜及及荧荧光光显显微微镜镜比比较较的的优优缺缺点点 44..全全内内反反射射荧荧光光显显微微术术应应用用
有效消除直到近红外范围的色差
最高级的UIS2物镜是UPLSAPO系列，它杰出的超级复消色差特点有效 地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差。这意味着从紫外到红 外范围内的成像都可以只用一个物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很 宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色 偏移
wa sa m plifiedt hreet imesin thef igure) [T PPSI-1.5x10 '-I-L’;[BSA]=6ig"-L-',P H425 1, 吕 k -1.,i- (丁PPS);2 ,B ulk solodon( TPPS十】3SA);
3, I n te rf ace (丁PPSI B SA
全内反射的应用
蛋白质吸附平衡 表面分子浓度梯度变化 表面分子的旋转 荧光寿命及反应速率的测量及选择性观
测细胞/底物接触区等 其中蛋白质界面吸附平衡是全内反射荧
光法的重点应用领域
1：关于测定蛋白质分的吸附平衡的应用
Thes ynchronousf luorescence spectra( Ax= 230r un)o f TP PS i nd if ferente nvironment( thei ntensityo fi nterface
CCD功用介绍
比较：
一般的光学显微镜： 分辨率为250nm
1
显微图像的信 噪比不高
2 光源对生物样 本照射的损伤
3
光学衍射所致 的分辨极限 （R≥ 0.61λ/nsin θ）
比较：
一般的光学 显微镜分辨率为250nm 因此有：1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生
物样本损伤小 与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统
全内反射的基本原理
全内反射与Snell 定律 ----Snell 定律
入射光在两介质接触面一部分发生反射，一部 关分系发由生折Sn射ell。定入律射角θ1和透射角θ2之间满足
θ2 =90° θc=sin-1(n 2/n 1) ----全内反射
生由。上即式所可有知的，入当射n1光大线于全n2部时反，射全出反来射称就为可全能内发 反射
放置样品的空间收到棱镜的限制
3
物镜
物镜型
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统
图4 物镜型全内反射荧光显微镜示意图
棱镜形和物镜型的简易光路图
拥有更宽波长范围内的高透过率
IX2系列的内置物镜采用UW多层鍍膜技术，能够有效消除超宽谱带上的反射， 在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外 范围内的透过率显著提高。总之，在较宽波长范围内的性能使它非常适合当今 最需要的研究用途。