全内反射荧光显微镜介绍
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
单分子荧光共振能量转移技术
研究生光谱技术与应用课程作业河南大学单分子荧光共振能量转移技术学生：郭爱宇学号：************学院：物理与电子学院年级专业：2012级光学工程课程名称：光谱技术及应用指导老师：郭立俊教授单分子荧光共振能量转移技术摘要：单分子荧光共振能量转移技术(single molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。
在单分子探测技术发展之前，大多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensemble averages)，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。
单分子探测可以对体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。
介绍了近来单分子荧光共振能量转移技术的进展。
关键词：单分子；荧光共振能量转移；荧光基团1 引言光谱技术是研究生物分子最常用的方法之一。
在单分子光谱（single molecule spectroscopy, SMS）探测技术发展以前，大多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。
而单分子探测可对体系中的单个分子进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。
2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。
主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等[1]。
由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。
标记在生物大分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度(molecular freedom of motion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。
荧光显微镜操作说明
一、荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。
它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。
是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像（一）光源现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50〜70个标准大气压力，这一过程一般约需5〜15min0超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。
它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此，为荧光显微镜普遍采用。
超高压汞灯也散发大量热能。
因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太局O新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压启动（约为15000V）,启动后，维持工作电压一般为50〜60V,工作电流约4A左右。
200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h,开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min,则寿命降低50%。
因此，使用时尽量减少启动次数。
灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。
灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。
点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，•般需要等15min0由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此灯泡必须置灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和发生爆炸时造成操作。
超高压汞灯（IOOw或200TV）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。
在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。
国产超高压汞灯GCQ-200型性能良好，可以代替HB0-200等型的进口灯泡，平均寿命在200h 以上，价格也比较低。
我国研制的一种简易轻便型高色温溟铝荧光光源装置，体积小，重量轻，功率小，交、直流两用（自带直流电源），易于携带，使用方便，已推广应用。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
7
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
8
TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
3
传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
11
TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
14
物镜型TIRFM系统
tirf显微镜原理
tirf显微镜原理简介：TIRF（Total Internal Reflection Fluorescence，全内反射荧光显微镜）是一种用于研究界面和薄膜附近的生物发光过程的高分辨率显微镜技术。
本文将解析TIRF显微镜的原理，包括全内反射现象、波导耦合和荧光检测等方面，帮助读者深入了解这种重要的显微镜技术。
正文：1. 全内反射现象TIRF显微镜利用全内反射现象实现高分辨率成像。
当光束从高折射率的材料（例如玻璃）射入到低折射率的材料（例如溶液）时，当入射角大于临界角时，光束将完全反射，不进入低折射率材料。
2. 波导耦合TIRF显微镜利用光波在玻璃和样品之间发生全内反射来实现荧光成像。
一种常用的方法是通过特殊设计的金属或玻璃叫做波导，将激光束耦合到玻璃和样品的边界上。
波导保证了光束以全内反射的方式沿界面传播，通过控制波导与样品之间的接触面积，可以使激光束只在非常薄的区域内与样品相互作用，实现高分辨率荧光成像。
3. 荧光检测TIRF显微镜利用荧光探针标记的样品发出的荧光信号来进行观察。
在TIRF成像中，仅有与表面接触的荧光染料将被激发并发射荧光。
未被激发的荧光将不被收集，从而有效地减少了背景信号的干扰，提高了信噪比和成像的分辨率。
4. 超分辨率成像TIRF显微镜在满足一定条件下能够实现超分辨率成像。
通过控制入射角度、荧光染料的位置和波导耦合等参数，可以限制荧光激发区域的大小，使得成像分辨率超越传统荧光显微镜的衍射极限，实现更高的空间分辨率。
5. 应用TIRF显微镜广泛应用于生物科学的研究领域，特别是细胞和分子生物学。
通过观察细胞膜和介观尺度结构之间的相互作用、细胞内分子交互作用以及染料的分子动力学等，TIRF显微镜为研究生命科学中的各种现象和过程提供了高分辨率的实时成像手段。
总结：TIRF显微镜利用全内反射现象和波导耦合技术，实现了高分辨率的成像和荧光检测。
通过限制光激发区域和减少背景干扰，TIRF显微镜能够提供超过传统荧光显微镜的分辨率。
全内反射荧光成像基本原理
hv H**
H hv
S2
吸
放
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
精品课件
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
精品课件
全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
精品课件
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
精品课件
精品课件
隐失波强度成指数衰减曲线
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
精品课件
当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
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4.吸附
• 用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分
子吸附行为 。
全内反射荧光显微镜下拍到 的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图
分别在全内反射荧光显微镜下（左）和 一般荧光显微镜（右）拍到的Dil-stainedneuron,细 胞。
• 全内反射荧光显微镜（TIRFM）是研究紧贴固体
隐失波的强度-深度图
荧光激发原理
T12（θi）- 分界面处的透射强度 θi - 入射角 d 12 - 渗透深度 λ - 入射光波长
透射强度和浸透深度公式
对于可见光波长 380 ～ 780nm而言， 浸透深度为～ 100nm。
箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。 黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子， 白色小圆点表示未被激发的荧光分子。
• 全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优
势(它的荧光激发深度只在～100 nm 的薄 层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生 物化学动力学、单分子动力学的最有前途 的光学成像技术。
• 全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成
像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像 的要求;另一方面它的图像解释相对于近场, 干涉显微成像来说也较简单。
荧光激发原理
snell定律:
n1sin θ1=n2 sin θ2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
荧光激发原理
非均匀波
沿着入射面上的介质边界传播 在平行界面方向以平行波场方式传播 在垂直界面方向则是呈指数衰减。
1. 全内反射荧光显微术 在生物单分子科学中的应用
• 单分子荧光探测主要有三个问题： • （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱
的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。 • （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光 等产生的背景光，极大的干扰了信号光的 探测。所以应该尽量降低背景激发光。 • （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景 光。
CCD相机的快速成像特点提 高了其时间分辨率，使得观察单分 子的运动、细胞物质的分泌、蛋白 质的相互作用成为可能并成为这方 面的优势观察仪器。 CCD相机的高灵敏度特点使 全内反射荧光显微镜利用消逝波照 射样品并使其成像成为可能，也成 就了其高信噪比。
CCD相机
当对活细胞 成像时,为了 达到单分子 级的灵敏度 或是为了减 少曝光时间, 需要采用图 像增强器。
全内反射荧光显微镜
发展与展望
优势应用
分型及结构
基本原理
发展历史
发展历史
荧光显微镜的概念
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射 后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但 如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射 亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性 和定量研究的工具之一。
发展历史
3.离子通道研究
• 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜
• •
调节离子电流和电化学势。 单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方 法来检测各种通道的电特性。 目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信 号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到 平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微 镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展 的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到 离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用， 同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。
解依荻
全内反射应用的核心问题
全内反射应用的核心问题是
制作与电子显微术（EM）切 片尺寸相当的光学切片。
共焦技术 VS.全内反射技术
共焦技术：单光子或双光子的共焦系统层析深 度分别为～500－800nm。 全内反射显微术: 典型的垂直照明深度 <100nm。 结论：薄的光学层析层切片信噪比强； 细胞的光损伤和光漂白影响也很小。
构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光 显微术。 • 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白， 然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光 基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象， 说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。
2.蛋白分子相互作用
• 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反
射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接 观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 • 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(cochaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相 互作用已经在单分子水平进行了很好的研 究。 • 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平 生物大分子相互作用的成像。
全内反射的应用比较
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和双光子激光扫描显 微镜（TPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术。 CLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集 光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦） 可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它 地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大 约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄 层的厚度（200nm）。
平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固 体支撑物具有相互作用，以及消逝波强度的指数 性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对 结果的解释具有一定的困难性。 因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技 术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。
•
The application of the total internal reflection fluorescence microscopy
目前使用CCD 探测, 可达到的量子产率 已到～80 % ,成像 速率～200 Hz.
全内反射显微镜的分型及其结构
全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不 同可分为棱镜型和物镜型两种类型
两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。
（一）棱镜型全内反射荧光显微镜
利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝 波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光 从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。
这些问题都可以利用全内反射荧光显微成 像系统来解决
全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的 过程进行观测，而不受到来自细胞内深层 区域信号的干扰。
全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学 如生物化学动力学、单分子动力学的最有 前途的光学成像技术
利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。
• 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态
二者比较
棱镜型全内反 射荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜
05级医学实验 宋一萌 90513111
பைடு நூலகம்
• 全内反射荧光显微技术利用全内反射产生
的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指 数衰减，使激发区域限定在样品表面的一 薄层范围内，因此具有其它光学成像技术 无法比拟的高信噪比。 • 当今世界上研究单分子科学最具前途的新 型生物光学显微技术之一 • 可用来实现对单个荧光分子的直接探测。
90年代 20 新型物镜透镜、聚光 世 镜和超灵敏探测器的 纪 出现，使TRIFM技术
得到充分发展。
Axelrod等生物物理 20 学家对TRIFM技术 世 及基本原理进行描 纪 述，并探索了其生 物应用。
80年代早期
1965年
Hirsch field
完成了 第一个 全内反射 荧光实验
基本原理
全内反射荧光显微镜 的基本设计思路
棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图
评价
棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光 光源、棱镜和显微镜。
在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。
放置样品的空间受到棱镜的限制。
（二）物镜型全内反射显微镜
收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜
发生全内反射的光学器件。
由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 , 因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大 于1. 38 。表达式为： NA = nsin（u/2） nsin（u/2） > nsinθc NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的 折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全 反射的临界角。
TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如 细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。
生物单分子荧光检测技术的比较
共聚焦激光扫描显微 （CLSM） 双光子激光扫描显微 镜（TPLSM） TPLSM对生物系统和 体内细胞性质具有高 的分辨率。双光子激 发能探索活细胞内各 种分子的实时动态， 能实现在样品中的高 度精确定位。减少了 光损伤，特别对需要 条件温和的生物体系 有利 全内反射荧光显微 镜（TIRFM） TIRFM具有高度的 界面（表面）特异 性，可有效排除本 体干扰，获取界面 信息。纵向分辨力 极高，特别适用于 表面或界面单分子 的测定。全内反射 荧光法相对简单， 费用低廉。表面 或界面单分子的测 定
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM） 双光子激光扫描显微镜（TPLSM）
全内反射的应用比较
全内反射荧光显微镜（TIRFM） 全内角反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope，TIRFM），利用光线全 反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分 子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围 通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性， 只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大 大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛 应用于细胞表面物质的动态观察。
• 现在全内反射荧光显微术已被广泛用于
• • • • •
实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动