全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
全内反射荧光成像基本原理
d12是渗透深度,它等于从分界 面处到光强衰减到分界面处数 值l/ e的处的距离。对于可见 光波长而言，浸透深度约为100 nm。
隐失波存在的实验证明
两块光密媒质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射波,这透 射波进人第二块棱镜。
精品课件
Snell定律：
n1>n2
光的反射和折射
Refracted n2 n1
TIR
精品课件
精品课件
当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达 到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：
90º
n2
n1
TIR
当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发 生了全内反射。
精品课件
隐失波
隐失波
NA = n sinθ n sin θ > n sin θc 其中，NA为物镜的数值孔径 ，n， θ分别为物镜的折 射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全内反射时的临界角。 物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且 容易校准光束。
精品课件
光学隧道效应
光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。当 光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波不仅 穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的电子 作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生了显 著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学隧道效 应的产生。
hv H**
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
TIRFM原理及应用
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
02.1 全反射
1. 2.
snell定律: n1sin θ 1=n2 sin θ 2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
02.2 隐失波
1.
如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33（生物细胞的折 射率范围是1.33-1.38），则玻璃／界面处的临界角为61.78°。从几 何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在剥离界面上完全反 射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能 量会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播。这部分光场就是所 谓的隐失波。
TIRFM在细胞生物物理研究中的应用
主讲人：秦继伟
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
01 TIRFM简介
全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反 射产生的隐失波激发样品,使样品表面数百纳米厚 的薄层内的荧光团受到激发，只有这个小范围内的 荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子 则完全不受影响。所以全内反射荧光显微术具有其 它成像方法无法比拟的高的信噪比，细胞的光损伤 和光漂白也很小。再用高灵敏度和高时间分辨率的 摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从 而实现对生物样品观测的一种技术。
正置荧光显微镜
倒置荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统的最大优点是在进行TIRFM实 验时可对样品进行其他操作，如改变样品介质、进行细胞显微注 射及微操作等。
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PC-linker
全内反射荧光显微术应用
现在全内反射荧光显微术已被泛广用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转 移( FRET) 、ATP 酶的翻转,聚合物内单 个分子的结构变化、以及等离子体膜附 近的神经分泌腺的颗粒运动等多方面。
全内反射荧光显微镜的发展展望
成像系统的消逝场 是通过入射光经物 镜本身全反射产生
棱镜型系统包括三个主要部分
(1) 倒置的相衬光学显微镜; (2) 可以二维精确移动的样品台; (3) 用来发生全反射的棱镜
棱镜型评价
1
棱镜型系统在实现上更加容易,它只 需要激光光源、棱镜和显微镜。
2
在探测上,它也不容易受到入射光信 号的干扰
3.全内反射荧光显微镜同原子 力显微镜结合的应用
Injected Fluorescent Beads
1) Silanization of whisker crystals 2) Modification of PC-linker 3) Immobilization of Fluorescent Beads
合适的pH值：PH:4.25
合适的TPPS的浓度：1.5x10-6 -1"L’
2.蛋白质的分泌：
A. 为刺激给予之前;B、C. 为刺激给予后 MIN6 细胞用吖啶橙荧光染料转染后给予50 mmol/ L 氯化钾 刺激,应用TIRFM 得到全反射影像
A1 为刺激给予之前;B、C1 为22mmol/ L 葡萄糖给予之后 MIN6 细胞应用吖啶橙荧光染料转染后给予高浓度葡萄糖刺激, 应用TIRFM 得到全反射影像。
放置样品的空间收到棱镜的限制
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立
文章编号：2095－6835（2022）05－0133－05基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验方法建立＊曹慧珍，王瑾瑜，王文娟（清华大学生物医学测试中心尼康生物影像中心，北京100084）摘要：发展了基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复（TIR/FRAP）的成像方法，该方法通过全内反射显微镜（TIRFM）和激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的联合使用，将全内反射荧光成像和荧光漂白后恢复技术相结合，可广泛用于研究质膜附近分子动力学特征。
LSCM对任意感兴趣区域（ROI）执行光漂白，TIRFM特异性采集漂白前后细胞质膜附近的荧光信号，通过NIS-Elements软件程序实现显微镜模式间的自动快速切换。
相比目前通用的基于全内反射的光漂白方法，这种方法具备灵活可变漂白区域的优势，可以满足大多数的基于全内反射的光漂白后恢复实验需求。
同时，这种技术方法也为开发TIRFM或LSCM与其他设备的联用方法奠定了实践基础。
关键词：全内反射显微镜；荧光漂白后恢复；自动切换；感兴趣区域中图分类号：Q336文献标志码：A DOI：10.15913/ki.kjycx.2022.05.041全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）特异性地照亮盖玻片/样品界面附近的荧光团，抑制来自细胞更深层的背景[1-2]，广泛应用于质膜附近的生物过程研究中，例如细胞粘附位点、囊泡胞吐和内吞作用或内质网/质膜接触位点等[3-4]。
荧光漂白后恢复（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）技术是研究分子迁移特性的技术。
基于全内反射显微镜的荧光漂白后恢复实验（Total Internal Reflection/Fluorescence Recovery After Photobleaching，IR/FRAP）将TIRFM和FRAP技术相结合，测量盖玻片/样品界面分子的动力学数据，是研究质膜附近分子动力学的有力工具[5]。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
简述全内反射荧光显微术的原理和应用摘要：全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从而实现对生物样品观测的一种新生技术。
由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高时间分辨率，因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。
本文将对全内反射荧光显微镜的原理及应用和发展展望作一个简要的介绍。
关键词：全内反射消逝波衍射极限单分子的动态观测0 引言：人类自诞生以来不但在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改进自己观察世界和了解这个世界的工具，其间显微镜的制造应改说为人类观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是人类观察认识世界上的一次革命。
此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认识达到了空前的高度。
但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsinθ,其中λ为成像光波波长, nsinθ为物透镜的数值孔径,即NA 值，因此光学显微镜空间分辨极限～250 nm。
于是人们研制了拥有点分辨率: 0.2nm的电子显微镜。
进入80年代，非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度。
但这些显微技术在不同程度上存在系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能象光学显微术那样提供重要的光学信息（如偏振态、折射率、光谱等）和进行无损伤性生物活体探测，这些因素均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。
近年来人们开发出了一系列光学显微镜如：目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术[1 ,2 ]和全内反射荧光显微术.其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性，使得这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域有着广泛应用，并将对未来的光测技术的发展和科学的进步产生深远的影响。
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TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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DiI染色的Hela细胞
TIRFM FLM
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细胞内液 (n=1.38) 水 (n=1.33)
n光束容易校准 n数值孔径越大，分辨率越高 n数值孔径大，有更多的激发光强 可以用来产生全反射 n全内反射角度调节范围更大
100x NA1.4
100x NA1.65
0.04mm
0.21mm
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NA 1.45
(WD 0.1-0.16mm, Cover glass thickness 0.13-0.19mm) 数值孔径1.45 工作距离0.1-0.16mm 可校正盖波片厚度0.13-0.19mm 可校正温度的影响23-37℃
NA 1.45
(WD 0.1mm) 数值孔径1.45 工作距离0.1mm
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TIRFM vs 激光共聚焦
TIRFM
・ 实时动态图像，速度快 ・ 深度大约 100nm ・ 高信噪比 ・ 单分子荧光信号探测
激光共聚焦
・ 可得到 Z 轴光学切片 ・ 可实现三维重构
TIRFM
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棱镜型TIRFM Vs 物镜型TIRFM
OLYMPUS OLYMPUS
安装简单 •可用于微分干涉观察DIC 高数值孔径物镜 •高数值孔径物镜 •可连接原子力显微镜AFM •可用于显微注射和膜片钳实验
DiI染色的神经元
TIRFM FLM
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S. Simon et. al/Rockefeller Univ.
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பைடு நூலகம்
• 钙离子通道实时监测
(w/ High Speed Camera) – Using Ca-green / M. Morad
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Dr. S. Simon, J. Schmoranzer / Rockefeller Univ. Dr. Axelrod / Univ. of Michigan
全内反射荧光显微镜的基本组成
•高级研究级显微镜
一般为倒置显微镜，配荧光照明器、高数值孔径的物镜
•TIRFM照明器
通过光纤接入激光，并对激光入射方向进行控制，通过L型照明器实现 和荧光照明器一起从荧光通道进入显微镜
•激光器
根据实验要求选择，可以接入单激光器或者多激光系统
•检测系统
应选择高灵敏度制冷CCD，要求CCD量子效能高，能够对极弱荧光进行 捕捉，具有上千倍的信号放大功能，如果是对快速荧光信号进行捕捉则 还需要高速CCD
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荧光观察图像景深范围
LSM
CCD 聚焦位置
• 胞吞/胞吐现象
– Exocytosis of single secretory granules in live cells using acridine orange / W. Almers
• 单分子荧光信号探测
– Using NA1.65 Objective Lens/ Dr. Terakawa – Myosin, Actin with Cy3 labeled ATP / T. Yanagida
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庞大完善的售后服务体系
显微镜完善的的服务体系
——覆盖全国的7家显微镜维修站 （北京、上海、广州、武汉、重庆、西安、济南）
强大的售前/售后技术支持
——市场技术部和技术服务部
全内反射照明的切换
全内反射照明
盖波片
物镜
激光
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光路结构
物镜 微分尺
光纤 视场光栏 激光
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UIS2无限远光学校正系统
• 从紫外到近红外（UV–NIR）都提供更优异的透过性能
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全内反射照明的切换
盖波片
物镜
激光
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改变入射激光角度
全内反射照明的切换
盖波片
物镜
激光
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荧光 —— 全球首次引入离子镀膜技术 “最明亮的荧光显微镜”
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双层V型光路、多光口输出——IX2
前置面板操作
内置多层光路
最符合亚洲人操作习惯的亚洲人机 工学设计，和前端操作设计
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TIRFM和荧光照明器共用
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多条激发光谱线可供选择
EM CCD ！！！！
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共聚焦显微镜方面的独创
世界第一家TIRFM技术厂家 世界最高分辨率物镜NA=1.65 世界唯一TRIFM+Confocal集成系统，结合了两者的优势
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全内反射的深度
Evanescent wave 1 Relative Intensity 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 50 100 Distance (nm) 150 200 E (1.65) E (1.45)
•UV 405 - 440nm 新的半导体激光器: UV 405/440nm 半导体激光器 (应用于荧光分子漂白和CFP荧光图像) • VIS 458 - 473 - 488 - 515 - 543 - 559 - 635 nm 多谱线Ar 离子激光器和新的半导体激光器
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全内反射荧光显微镜系统
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
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対物レンズ
θC θmax
发生条件
n θ > θc (TIR angle)
sinθc = n2/ n1 D
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