生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。
我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。
应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。
两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。
蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。
在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。
蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。
目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。
毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。
生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。
是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。
近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。
这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。
质谱检测磷酸化位点
质谱检测磷酸化位点质谱检测磷酸化位点磷酸化是一种常见的细胞信号传递方式，它涉及到许多生物体内的重要功能和代谢过程。
磷酸化通常是通过酶催化的过程来完成的，这种过程可以在细胞中发挥重要的作用，从而调节许多细胞生理和生化过程。
质谱技术作为一种能够非常准确地检测生物大分子结构和化学修饰的方法，已经被广泛应用于检测蛋白质分子的磷酸化位点。
磷酸化已经被证明对许多重要的生理过程发挥着至关重要的作用，如代谢、信号传导，细胞增殖、分化和凋亡等。
许多的细胞机制都是通过磷酸化来实现的。
因此，检测磷酸化位点以及分子机制的研究对于理解细胞信号通路和代谢途径的调节至关重要。
质谱技术作为一种高灵敏度的分析方法，已经被广泛应用于蛋白质磷酸化的研究。
这种方法非常适合于检测蛋白质上的磷酸化修饰位置，因为它不仅可以检测蛋白质的质量，而且还可以同时检测其修饰位置。
这种方法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优势，因此适用于大规模的磷酸化位点的筛选和鉴定研究。
在质谱技术中，主要使用质谱分析仪来研究蛋白质和修饰分子的化学和物理特性。
利用电喷雾质谱仪（ESI-MS）或是基质辅助激光解吸/离子化质谱仪（MALDI-TOF-MS）等质谱分析仪器，可以得到蛋白质的质量信息以及化学修饰信息。
在目前的研究中，一些研究者还将质谱技术与低温离子化电离质谱（LTQ-Orbitrap）和离子诱导解离/碎片化（CID/ETD）等技术相结合，以完成更加高效的磷酸化位点的筛选和鉴定。
除了质谱技术，生物芯片技术也被广泛用于磷酸化位点的检测。
例如，磷酸化特异性抗体数组可以用于研究酶促磷酸化事件，这种方法可以直接检测磷酸化的靶蛋白和磷酸化位点。
然而，与质谱技术相比，磷酸化特异性抗体的基础更为狭窄，这种方法受到抗体选择和特异性的限制比较大。
在磷酸化位点研究的应用中，目前的研究主要集中在三类蛋白质：激酶、转录因子和膜蛋白质。
这些蛋白质在生理和病理中发挥着至关重要的作用。
因此，发现和鉴定它们特定的磷酸化位点对于了解这些重要分子的功能非常重要。
磷酸化质谱
磷酸化质谱
磷酸化质谱是一种用于研究蛋白质磷酸化的分析方法。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰，它能够调节蛋白质的功能、定位和相互作用。
磷酸化质谱通过将蛋白质酶切成小片段，然后用质谱仪分析这些片段中的磷酸化位点，从而确定蛋白质的磷酸化模式和位置。
磷酸化质谱的过程包括样品制备、酶解、富集和质谱分析。
首先，样品需要经过预处理，包括去除污染物和离子对样品的影响等。
然后，样品被酶解成小片段，通常是通过胰蛋白酶消化。
接下来，磷酸化位点需要被富集，通常是通过亲和层析法或磷酸化特异性抗体捕获。
最后，富集后的样品被送入质谱仪进行分析，通过检测质量/电荷比和碎片离子的质量，确定蛋白质的磷酸化情况。
磷酸化质谱在蛋白质组学、信号转导和疾病研究等领域具有广泛的应用。
它能够帮助研究人员了解蛋白质的功能、调控机制和相互作用，以及研究疾病发生发展的分子机制。
同时，磷酸化质谱还可以用于新药研发和药物筛选，为药物研发提供重要的分子信息。
总之，磷酸化质谱是一种重要的分析方法，对于研究蛋白质磷酸化和相关生命科学领域具有重要意义。
质谱鉴定磷酸化位点
质谱鉴定磷酸化位点
质谱鉴定磷酸化位点是一种通过质谱技术来鉴定蛋白质分子中磷酸化位点的方法。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，可以影响蛋白质结构和功能。
因此，研究蛋白质中的磷酸化位点对于理解蛋白质的功能调控具有重要意义。
质谱鉴定磷酸化位点一般包括以下步骤：提取蛋白质，酶解蛋白质，富集磷酸化肽段，质谱分析并鉴定磷酸化位点。
其中，富集磷酸化肽段是关键的步骤，常见的富集方法包括亲和层析、钛离子层析和IMAC等。
质谱分析是鉴定磷酸化位点的关键环节。
常用的质谱技术包括MALDI-TOF和ESI-MS等。
通过质谱鉴定磷酸化位点，可以得到蛋白质的磷酸化修饰情况，为后续的蛋白质功能研究提供重要数据。
总之，质谱鉴定磷酸化位点是一种重要的蛋白质研究方法，对于揭示蛋白质功能调控机制有着重要的作用。
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生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
蛋白质磷酸化检测方法
蛋白质磷酸化检测方法蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号转导过程，对于细胞的生命周期、增殖、分化和凋亡等过程起着关键的调控作用。
因此，研究蛋白质磷酸化具有重要的生物学意义。
本文将介绍蛋白质磷酸化的检测方法。
蛋白质磷酸化是通过将磷酸基团与蛋白质分子中的特定氨基酸残基（通常是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）发生酯化反应而实现的。
磷酸化事件的发生可以改变蛋白质的构象、电荷和亲和性，从而调控蛋白质的功能。
因此，准确、高效地检测蛋白质磷酸化状态对于揭示细胞信号转导网络的正常功能和疾病机制具有重要意义。
常用的蛋白质磷酸化检测方法主要包括免疫印迹、质谱分析和磷酸化特异性抗体法。
免疫印迹是一种常用的蛋白质磷酸化检测方法，它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
这种方法操作简便、成本低廉，可以检测多个磷酸化位点。
然而，免疫印迹方法受到抗体的特异性和灵敏度的限制，且无法确定磷酸化的具体位点。
质谱分析是一种高度灵敏的蛋白质磷酸化检测方法，它基于质谱仪对蛋白质及其修饰产物的质量和电荷进行精确测量。
质谱分析可以通过直接检测磷酸化肽段的质量来确定蛋白质的磷酸化位点。
这种方法可以同时检测多个磷酸化位点，并且能够鉴定未知的磷酸化位点。
但是，质谱分析方法需要复杂的样品前处理和数据分析，操作技术要求较高，对设备和实验条件也有一定要求。
磷酸化特异性抗体法是一种基于特异性抗体识别磷酸化氨基酸残基的蛋白质磷酸化检测方法。
该方法利用磷酸化特异性抗体与磷酸化蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
与免疫印迹相比，磷酸化特异性抗体法可以准确地确定磷酸化的位点。
但是，该方法也受到抗体的特异性和灵敏度的限制。
除了上述常用的蛋白质磷酸化检测方法之外，还有一些新兴的技术在蛋白质磷酸化研究中得到了广泛应用。
例如，蛋白质芯片技术可以同时检测上千个蛋白质的磷酸化状态，从而在大规模的磷酸化研究中发挥了重要作用。
磷酸化位点鉴定
磷酸化位点鉴定磷酸化是细胞内一种重要的化学修饰方式，通过磷酸化修饰蛋白质分子，可以调控细胞信号传导、基因转录、蛋白质结构和功能等关键生物过程。
因此，磷酸化位点的准确鉴定对于揭示蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。
在过去的几十年里，研究人员通过多种方法对磷酸化位点进行了鉴定。
其中最常用的方法是质谱分析技术。
质谱分析技术基于蛋白质分子的质量和电荷特性，可以准确测定蛋白质中磷酸化位点的位置和数量。
质谱分析技术通常包括前处理、质谱仪测定和数据分析三个步骤。
前处理是质谱分析的第一步，其主要目的是从复杂的蛋白质混合物中提取目标蛋白，去除其他干扰物。
前处理方法包括蛋白质提取、蛋白质消化和磷酸化肽片段富集等。
蛋白质提取是将目标蛋白从细胞或组织中提取出来，常用的方法有细胞裂解、组织切片和血清分离等。
蛋白质消化是将蛋白质分子酶解成肽段，常用的酶有胰蛋白酶和胃蛋白酶等。
磷酸化肽片段富集是通过化学反应或亲和层析等方法富集含磷酸化位点的肽段，以提高其在质谱分析中的检测灵敏度。
质谱仪测定是质谱分析的核心步骤，其主要目的是测定蛋白质和肽段的质量和电荷特性。
常用的质谱仪包括MALDI-TOF、ESI-TOF和Q-TOF等。
MALDI-TOF质谱仪基于基质辅助激光解析电离离子化技术，可以测定蛋白质的分子质量。
ESI-TOF质谱仪基于电喷雾电离技术，可以测定蛋白质和肽段的质量和电荷比。
Q-TOF质谱仪基于四极杆和时间飞行二次质谱仪的结合，具有高分辨率和高灵敏度。
质谱仪测定的结果通常以质谱图的形式呈现，通过质谱图可以确定磷酸化位点的位置和数量。
数据分析是质谱分析的最后一步，其主要目的是从质谱数据中提取有用的信息。
数据分析方法包括数据库搜索、序列比对和谱图解析等。
数据库搜索是将质谱数据与已知蛋白质序列进行比对，以确定磷酸化位点的位置和数量。
序列比对是将质谱数据与已知蛋白质序列进行比对，以确定磷酸化位点的保守性和功能。
谱图解析是将质谱数据与已知谱图进行比对，以确定磷酸化位点的质量和电荷特性。
磷酸化位点的精确定位：质谱技术的实验设计与分析流程
磷酸化位点的精确定位：质谱技术的实验设计与分析流程磷酸化是蛋白质修饰中的一种重要形式，对于调控蛋白质的结构和功能起着关键作用。
质谱技术是一种强大的工具，可以帮助我们精确定位蛋白质中的磷酸化位点。
本文将详细介绍质谱技术在磷酸化位点研究中的实验设计和分析流程，着重强调质谱如何帮助我们发现和验证磷酸化位点。
一、实验设计在磷酸化位点的研究中，实验设计是非常重要的一步。
以下是一些关键的实验设计要点：1.样品准备：样品的选择和制备非常重要。
通常，我们会选择含有磷酸化位点的蛋白质样品，并确保其纯度和完整性。
2.消化酶选择：酶的选择对于磷酸化位点的检测至关重要。
常用的酶包括胰蛋白酶、胰蛋白酶K和胰蛋白酶LysC等。
需要根据样品的特性和磷酸化位点的位置选择适当的酶进行消化。
3.磷酸化酶切：磷酸化位点通常会被特定的磷酸化酶切割，以将磷酸化残基暴露在消化产物中。
这有助于质谱的检测和定位。
二、分析流程质谱分析是磷酸化位点研究的关键步骤。
以下是质谱分析的流程：1.质谱仪的选择：质谱仪的选择取决于实验的需求和目标。
常用的质谱仪包括MALDI-TOF质谱仪、ESI质谱仪和Q-TOF质谱仪等。
2.质谱条件优化：针对磷酸化位点的特性，需要优化质谱条件。
包括碰撞诱导解离（CID）能量、碰撞能量和质谱扫描模式等参数的设定。
3.数据采集与解析：通过质谱仪采集数据，并使用数据分析软件进行解析。
常用的软件包括Mascot、MaxQuant和Skyline等。
通过与数据库比对，可以识别出磷酸化位点，并确认其定位。
三、磷酸化位点的验证磷酸化位点的验证是确保研究结果的可靠性和准确性的关键步骤。
以下是常用的验证方法：1.荧光标记酶切法：可使用磷酸化特异性的酶对样品进行切割，然后使用质谱分析来确认磷酸化位点。
2.磷酸酶处理法：可使用磷酸酶对磷酸化位点进行去磷酸化处理，然后使用质谱分析来验证磷酸化位点。
3.定点突变法：可通过定点突变将磷酸化位点改变为非磷酸化位点，然后使用质谱分析来确认磷酸化位点。
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磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
然而，由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，磷酸化肽的质谱信号会被非磷酸化肽的质谱信号压制,因此在磷酸化蛋白的质谱分析鉴定前，依然需要结合富集技术以便于提高信噪比。
而发展至今，传统的分析方法耗时长，成本高或是效率低，并不能给出一个快速高效的磷酸化蛋白分析策略。
另一方面，由于传统的酶解技术耗时长，序列覆盖度低，也对位点鉴定造成了一定的困难。
所以尽管已有多种方法分离与鉴定磷酸化蛋白，但由于磷酸化的多样、动态、微量等性质，使其目前仍然是生物化学中的难题。
近年研究发现，二氧化钛等一些含有金属原子的纳米颗粒可以选择性的把磷酸化蛋白从混合溶液中富集出来，特别是含铁的磁性纳米颗粒已经显示出其巨大优势。
磷酸化蛋白分析要求超小体积、灵敏度高、选择性好的分析技术，蛋白质在线酶解技术凭借其快速、高效的酶解过程为各类需要快速酶解的相关领域提供了一个崭新的技术平台。
本项目利用四氧化三铁纳米磁性球对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，实现快速，高效的磷酸化蛋白与肽段富集，并结合蛋白质在线酶解技术，以提高蛋白酶解速度与效率，建立一个从混合蛋白到位点鉴定的快速分析策略。
该方法与传统方法比，将会有集成化高，样品损失少，速度快等优点，既适合做特定磷酸化蛋白的快速鉴定，也适合用于高通量，大规模的蛋白质组学研究。
2.实验部分2.1.仪器与试剂4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystem公司)；微流泵74900 Series (Cole-Parmer Instrument Company)。
Fe3O4纳米磁性球为自制；石英毛细管空柱(75μm i.d.)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。
细胞色素c (Cytochrome c, from Horse Heart)、肌红蛋白(Myoglobin, from Equine Skeletal Muscle)、磷酸化蛋白β-Casein(from Bovine Milk)、测序级胰蛋白酶(Trypsin, from Bovine Pancreas)为德国Sigma公司产品；牛血清蛋白(Bovine Serum Albumir)为上海华舜生物工程有限公司产品；其它试剂均为国产分析纯。
2.2.Fe3O4纳米磁珠的合成根据文献(11)，用水热合成法自制磁珠。
具体方法是:把FeCl3·6H2O(1.35g，5mmol)溶于乙烯乙二醇(40mL)中，形成澄清溶液后加入醋酸钠(3.6g)，强烈振摇60min然后密封在具聚四氟乙烯条纹的不锈钢高压锅(容量为50mL)中，加热至200℃8-72h,再冷却至室温。
黑色产物用乙醇、去离子水洗涤数遍，在60℃下干燥6h。
图2 在线固定化酶微反应器制作流程图把纳米磁珠加入到混合蛋白质或肽段溶液中(每200μl 溶液中加入4μl 磁珠)，室温下放置10min 以使磁珠吸附上磷酸化蛋白或肽段。
然后用磁铁分离磁珠，吸去清液。
再用10%ACN1%HAc溶液(pH=2.8)洗涤两次以除去杂肽，再用200mM 氨水(pH=11)洗脱。
2.4.在线酶解2.4.1.在线固定化酶微反应器的准备首先，用0.1M NaOH 溶液预处理毛细管30min 。
然后分别用去离子水、HDB 溶液（0.1%）、去离子水分别洗5min 使毛细管壁覆盖正电荷。
除尽管中的水，注入胰蛋白酶，停留5min 使酶通过离子键固定在毛细管壁上。
用25mM NH 4HCO 3洗管3min 以除去过量的酶。
（所有溶液均通过微流泵注入毛细管）2.4.2.在线酶解37℃下把蛋白注入毛细管，在毛细管另一端收集反应后的溶液即为酶解后的肽段溶液。
2.4.3.酶微反应器的再生当固定的酶功减弱，可以用1M NaCl ，0.1M HCl ，0.1M NaOH 连续的洗毛细管以洗提固定的酶（解吸附作用），重复2.3.1的步骤重新固定上酶。
图1 磷酸化蛋白或肽段的富集过程图 Washing solution: 10% acetonitrile and 1% acetic acid (pH=2.8) Elution solution: 200 mM ammonia (pH 11)为匹配在线酶解，尝试改变磷酸化肽段富集溶液，以优化磷酸化肽段富集条件。
每200μl原液直接加入20μl ACN 和1%醋酸调整pH，其他条件不变。
然后直接使用磁性材料如步骤2.2做富集、洗脱。
2.6.质谱鉴定洗脱得到的肽段用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-串级质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定并以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，测定各肽段的质谱数据。
数据通过GSP 查询软件再在相应的查询条件下搜索数据库MASCOT得到各蛋白的信息。
3.结果与讨论3.1.在线酶解效果由于硅烷醇基团的离子化，石英毛细管内表面本来就带有负电荷，使得酶无法被吸附在裸露的内表面，因此必须用一种水溶性的、有强阳离子基团的聚电解质作为离子交换剂来修改毛细管壁所带电荷。
本实验里使用聚阳离子电解质HDB来使管壁覆盖上一层阳离子，这种修改方法只要通过把HDB溶液注入毛细管这样简单的步骤就可完成，而且覆盖的这层HDB在其他流动溶液的冲洗下仍可保持足够的稳定。
更重要的是，HDB分子拥有高密度的季铵基团，可作为固定酶的强阴离子交换剂。
如图2所示，固定化酶微反应器通过简单的两步反应就可制成。
此法制在线固定化酶微反应器的优点主要有：(1)方法简单，可通过设备自动化实现；(2)酶的固定是可逆的，因而微反应器可以简单的被更新；(3)酶固定的条件温和，因而酶的活性可以最大限度地被保留。
如图3所示，为BSA与Cyt-c在线酶解后的质谱鉴定结果。
在相应的查询条件(S/N：50；Peptide tol.：±150ppm；Database：Swissport；missed cleavages allow：1)下搜索MASCOT 数据库，得到匹配肽段数分别为15和6，序列覆盖度分别为28%和44%。
3.2.材料富集条件试验为了检验酸度和盐度对材料富集结果的影响,我们进行了一系列的条件试验。
对于酸度，我们使用了不同浓度的HCl、TFA和HAc来调整不同的pH值，得出使用HAc的效果是最好的。
另一方面，我们发现酸度越高，回收率也越高，而质谱鉴定的信号强度却越低。
对于盐度，我们分别使用了NH3·H2O、100mM NH4HCO3和200mM NH4HCO3来作洗脱，结果显示分别不大，也就是说盐度对富集结果影响不大。
但是为了与在线酶解匹配，选择使用200mM NH4HCO3来作洗脱液。
图3 BSA与Cyt-c在线酶解后的质谱鉴定结果(基质为CHCA)Mascot搜库条件：S/N: 50; Peptide tol.: ±150 ppm; Database: Swissport; missed cleavages allow; 1本实验里用含有5个磷酸化丝氨酸残基的标准蛋白β-Casein来作优化富集过程和MALDI-TOF MS描述的磷酸化蛋白模型。
已知β-Casein有三个可能存在的可被Trypsin酶解的磷酸化肽段，分别在MH 2061.8 Da，MH 2556.1 Da和MH 3122.0 Da，它们具体的氨基酸序列见表1。
图4为用Fe3O4纳米磁珠富集含10ng/μlβ-Casein的25mM NH4HCO3溶液前后的质谱图。
图4a中，富集前，m/z2061的峰受到了明显的信号压制，而图4b所见，经过富集后m/z2061的峰信号得到了明显的增强。
表1 β-Casein 中磷酸化肽段的具体序列信息Phosphopeptides sequence Peptide residues [MH]+(Da)FQ p SEEQQQTEDELQDK β-Casein 33-48 2061.8 FQ p SEEQQQTEDELQDKIHPF β-Casein33-5 2556.1 RELEELNVPGEIVE p SL p S p S p SEESITR β-Casein 1-25 3122.0ab图4 Fe3O4纳米磁珠富集含10ng/μlβ-Casein的25mM NH4HCO3溶液前后质谱图比较(基质为CHCA)a)原液的MALDI-TOF MS谱图；b)材料富集后，用200mM 氨水洗脱得到富集液的MALDI-TOF MS谱图。
3.3.磷酸化肽段的富集结果为了研究此方法的效率，我们用含有一种磷酸化蛋白(50ng/μlβ-Casein)和三种非磷酸化蛋白(200ng/μl BSA, 100ng/μl Myoglobin和50ng/μl Cyt-c)的蛋白混合物作为蛋白模型。