磷酸化位点的预测分析
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。
我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。
应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。
两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。
蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。
在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。
蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。
目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。
毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。
生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。
是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。
近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。
这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。
蛋白的磷酸化和糖基化位点预测
百泰派克生物科技蛋白的磷酸化和糖基化位点预测蛋白质磷酸化和糖基化是常见的蛋白质翻译后修饰，能在一定程度上影响蛋白质的结构和生物学功能，使被修饰的蛋白质发挥特殊的调控功能。
蛋白磷酸化是在特异性蛋白激酶催化作用下，蛋白氨基酸残基共价结合三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP）的过程。
该修饰是可逆的，在蛋白磷酸酶的作用下，蛋白质可以发生去磷酸化。
蛋白磷酸化位点分析即鉴定蛋白质磷酸化发生在肽链的几号位氨基酸上以及发生在何种氨基酸上。
可通过磷酸酶法、串联质谱测序法等方法进行检测，其思路大致为将样品蛋白进行酶解，得到肽段混合物，然后特异性识别并富集发生磷酸化的肽段，再对该肽段的氨基酸序列进行分析，找出发生磷酸化的位点。
蛋白糖基化修饰在真核生物中非常普遍，几乎有一半以上的蛋白质发生了这种修饰。
蛋白糖基化一般发生在特定位点的氨基酸残基上，根据发生糖基化修饰的氨基酸位点以及结合的糖链类型，可以将糖基化修饰分为N-糖修饰、O-糖修饰以及糖基磷脂酰肌醇锚三类。
蛋白糖基化位点分析主要研究蛋白质在哪个氨基酸位点发生何种糖基化。
其大致的分析策略是先检测或确定糖蛋白的存在并对其进行富集分离；然后利用生物质谱结合蛋白酶或专一性糖苷内切酶的作用对收集的糖蛋白进行糖基化氨基酸位点鉴定，再将糖基化位点进行特异的质量标记使之与未发生糖基化的蛋白质之间存在一定的质量差异，通过质谱分析检测这些差异，进而通过串联质谱鉴定该糖基化修饰发生的氨基酸位点；最后进行糖链结构鉴定以确定发生的糖基化类型，这是整个鉴定工作中最难最复杂的一步，目前主要采用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOF-MS）和核磁共振（NMR）技术进行研究。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，为广大科研工作者提供蛋白质糖基化位点检测一站式服务，只需要将您的需求告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责项目所有后续，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化或糖基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析所有事宜，并为您提供详细的中英文双语版技术报告。
生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
mapk蛋白磷酸化位点 解释说明以及概述
mapk蛋白磷酸化位点解释说明以及概述1. 引言1.1 概述MAPK蛋白是一类重要的信号转导分子，参与调控细胞内生物学过程。
作为MAPK蛋白的特殊位点，磷酸化位点在信号传导中起着关键作用。
本文旨在对MAPK蛋白磷酸化位点进行解释和说明，并概述其在细胞信号传导中的重要性。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分：引言、MAPK蛋白磷酸化位点、MAPK蛋白磷酸化位点的作用机制、应用和意义以及结论。
其中，引言部分将对文章的概述、结构和目的进行介绍。
1.3 目的本文旨在详细探讨MAPK蛋白磷酸化位点的定义、概念以及其在细胞信号传导中扮演的角色。
通过深入剖析MAPK蛋白磷酸化位点的作用机制和信号传导路径调控机制，我们将进一步了解其在生理和病理条件下所承担的功能。
此外，我们还将讨论MAPK蛋白磷酸化位点作为生物标志物的潜在应用前景以及其在药物靶向研究中的重要性。
最后，我们将总结本文的主要内容，并提出未来研究方向和展望MAPK蛋白磷酸化位点在临床应用中的前景。
通过本文的阐述，我们将能够更加全面地认识和理解MAPK蛋白磷酸化位点以及其在生命科学领域中的重要性。
2. MAPK蛋白磷酸化位点2.1 MAPK蛋白概述MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）是一类重要的信号转导蛋白激酶，在细胞内起着关键的调控作用。
它们参与调节许多重要生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和应激响应等。
MAPK家族包括ERK（Extracellular signal-regulated kinase）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）和p38MAPK等亚家族，它们通过磷酸化底物蛋白来传递外界刺激信号。
2.2 磷酸化概念解释磷酸化是指在生物体内加入磷酸基团（PO4）3-到底物分子中的过程。
MAPK 蛋白的活性通常通过磷酸化机制来调节。
MAPK会被上游激活的激酶以级联反应的方式磷酸化，并进而转导信号到下游靶标分子，从而改变细胞内生理状态。
磷酸化位点的预测分析
(/xpd/xpd.htm) [WKK04]。
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4.1.Phosphosite
Phosphosite是由 CST(Cell Signaling Technology)开发的一个生物信息数据库。整合了 所有人类和老鼠体内磷酸化蛋白修饰位点信息， 这些信息包括修饰位点发布的参考文献、以修饰 位点为中心的多肽序列、定位于哪些已知的 domains和motif、研究这些位点所需的抗体来源、 以及一些相关链接。用户可以根据磷酸化蛋白质 名称、Swiss-Prot库中蛋白质ID、磷酸化修饰氨基 酸残基的名称和在蛋白质序列中的位置、提交者 姓名、CST编号、domains或motif、氨基酸序列来 查询磷酸化蛋白质。
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4.4. SWISS-PROT
SWISS-PROT数据库也是一个较常用磷酸化 蛋白质数据来源。它是由EMBL核苷酸序列库翻译 而来最齐全的注释精炼的蛋白序列库，最新版本 包含216380条蛋白质。在数据库的注释信息 Feature Tabel中可以查询到蛋白质修饰的相关信息， 其中MOD_RES项包含蛋白质发生的翻译后修饰的 名称、修饰位点等相关信息，磷酸化蛋白质修饰 位点信息可以通过此项查询到。
1.1.丝氨酸的磷酸化
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1.2.苏氨酸的磷酸化
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1.3.酪氨酸的磷酸化
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2.磷酸化的意义
蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中的酪氨酸、 丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的 羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白 质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步 引起蛋白质活性的变化，这也是蛋白质磷酸化的 意义所在。
磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式 之一，与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌 症机理等诸多生物学问题密切相关。
常见的蛋白质磷酸化位点
常见的蛋白质磷酸化位点
蛋白质磷酸化是一种常见的后转录修饰方式，可以改变蛋白质的结构和功能。
在细胞信号传导和代谢调节等生物学过程中，磷酸化是一种重要的调节机制。
以下是一些常见的蛋白质磷酸化位点：
1. 丝氨酸磷酸化位点：丝氨酸是最常见的磷酸化位点之一，能够影响蛋白质的构象和功能。
2. 酪氨酸磷酸化位点：酪氨酸磷酸化常被用于调节酪氨酸激酶的活性，从而影响信号传导和细胞增殖。
3. 赖氨酸磷酸化位点：虽然赖氨酸磷酸化不太常见，但在某些蛋白质中也会出现，并被认为与细胞周期和增殖有关。
4. 鸟氨酸磷酸化位点：鸟氨酸磷酸化在很多生物过程中都发挥了重要功能，包括细胞凋亡、代谢调节和信号传导等。
以上是一些常见的蛋白质磷酸化位点，了解这些位点对于理解细胞信号传导和调节机制非常重要。
- 1 -。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来.1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。
磷酸化位点的预测分析
磷酸化位点的预测分析磷酸化是一种广泛存在于细胞内的共价修饰方式，通过将磷酸基团与蛋白质残基中的氨基酸残基（通常为丝氨酸、蘇氨酸或酪氨酸）结合，可以调控蛋白质的结构、功能和互作。
磷酸化位点的预测分析可以帮助我们理解磷酸化的生物学功能、作用机制以及与疾病的关联。
在本文中，我们将讨论磷酸化位点的预测方法、常见的预测算法以及它们的应用。
基于实验数据的方法包括质谱分析和抗体法。
在质谱分析中，通过质谱仪测定蛋白质样品中磷酸化残基的质量和位置，从而确定磷酸化位点。
这种方法可以提供高通量的磷酸化位点信息，但需要大量的实验时间和资源。
抗体法是通过特异性抗体与磷酸化蛋白结合，然后通过免疫共沉淀或免疫组化等技术方法来检测磷酸化位点。
这种方法对于磷酸化位点的鉴定和定量较为敏感，但仍需要验证和进一步分析。
基于计算机算法的方法是通过分析蛋白质序列和结构特征来预测磷酸化位点。
下面我们将介绍几种常见的预测算法。
1. 序列检索法：利用公开的数据库，如UniProt，与已知磷酸化位点具有相似序列特征的蛋白质。
这种方法基于假设，即具有相似序列的蛋白质可能具有相似的功能和磷酸化位点。
2. 机器学习方法：通过分析已知的磷酸化位点和非磷酸化位点的序列和结构特征，训练模型来预测未知蛋白质序列中的磷酸化位点。
常用的机器学习算法包括支持向量机（SVM）、随机森林（Random Forest）和人工神经网络（Artificial Neural Network）等。
3. 结构基因组学方法：利用蛋白质的三维结构信息，预测磷酸化位点。
这种方法基于假设，即磷酸化位点通常位于蛋白质的一些结构域或域间区域。
常用的结构基因组学方法包括THreader、NetSurfP和Phospho3D等。
这些预测算法往往结合使用，以提高预测的准确性和可靠性。
此外，还有一些综合性的磷酸化位点数据库和在线工具可供使用。
例如，PhosphoSitePlus、Phospho.ELM、PhosphoNet和PhosphoNetX等数据库可以提供已知的磷酸化位点信息，并具有预测功能。
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31P检测
电子捕获解离
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3.1.1. MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合
磷酸酯酶处理后,磷酸化的肽会丢失磷酸 基团而产生特定质量数的变化, MALDITOF-MS通过检测这种质量数的变化而确定 磷酸化位点。Larsen等设计了一种可以直接 在样品靶上进行肽混合物磷脂酶处理的方法, 并评价这种方法能准确鉴定磷酸化位点,且 在凝胶的带上或点上应至少有1 pmol蛋白质 存在。
3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化 在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。
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3.磷酸化位点的预测方法 试验检测 计算生物学技术
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3.1.试验检测
Edman降解法
MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合
源后裂解
基于MALDI-TOF-MS的其他分析方法
前体离子扫描
中性丢失扫描
逐级改变取样锥电势
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3.2.2.预测系统所采用的方法
系统名称 NetPhosK PredPhospho
DISPHOS
GPS nasePhos
现有预测磷酸化位点系统所采用的方法
方法
提取的特征
神经网络
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
SVM
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
修饰位点邻近氨基酸序列特征，蛋白质disorder
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1.什么是蛋白质磷酸化
指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基 转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏 氨酸、酪氨酸）上的过程，或者在信号作用 下结合GTP，是生物体内一种普通的调节方 式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
某个信号蛋白磷酸化通常造成下游的蛋 白依次发生磷酸化，形成磷酸化级联反应。
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3.3.蛋白质磷酸化位点分析的困难
蛋白质磷酸化在体内是一种不稳定的动态 过程 ;
磷酸化蛋白质在细胞内丰度较低 ;
磷酸化蛋白质的磷酸基团很容易在分离过 程中丢失 ,且因其负电性而难于质子化 。
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4.相关数据库
1.Phosphosite (/) [HCK04] ； 2.Phospho Base (http://www.cbs.dtu.dk/databases/Phospho Base/) [KBB99] ； 3.Phosphorylation Site Database (/xpd/xpd.htm) [WKK04]。
1.1.丝氨酸的磷酸化
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1.2.苏氨酸的磷酸化
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1.3.酪氨酸的磷酸化
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2.磷酸化的意义
蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中的酪 氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上 具有游离的羟基，且本身不带电荷，当磷酸 化作用后，蛋白质便具有了电荷，从而使结 构发生变化，进一步引起蛋白质活性的变化， 这也是蛋白质磷酸化的意义所在。
磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰 方式之一，与信号转导、细胞周期、生长发 育以及癌症机理等诸多生物学问题密切相关。
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2.1.蛋白质磷酸化的功能
1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸 化为反应性中间产物,如在磷酸烯醇型丙酮 酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统的组氨酸蛋 白激酶;
2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋 白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和 苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨 酸残基);
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4.1.Phosphosite
Phosphosite是由 CST(Cell Signaling Technology)开发的一个生物信息数据库。整 合了所有人类和老鼠体内磷酸化蛋白修饰位 点信息，这些信息包括修饰位点发布的参考 文献、以修饰位点为中心的多肽序列、定位 于哪些已知的 domains和motif、研究这些位 点所需的抗体来源、以及一些相关链接。用 户可以根据磷酸化蛋白质名称、Swiss-Prot库 中蛋白质ID、磷酸化修饰氨基酸残基的名称 和在蛋白质序列中的位18置、提交者姓名、
基于对数回归的线性分 类器
预测结果特征，二级结构预测结果特征，理化性质
特征，激酶种类
基于马尔科夫聚类算法
修饰位点邻近氨基酸序列相似度矩阵BLOSUM,激 酶种类
HMM模型
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
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3.2.1.主要的机器学习算法
人工神经网络( Artificial Neural Netw o rk , ANN) ； 支持向量机( Suppo rt Vecto r M achine , SVM) ； 隐马尔可夫模型( Hidden M arkov M odel , H M M) ； 对数比回归模型( logistic reg ressio n m odels) ； 位置特异得分矩阵( position -specific scoring m atrix , PSSM) ； 信息熵( Inform ation -Entropy)； 贝叶斯决策理论( Bayesian decision theo ry , BDT) ； 加权投票( weig hted vo ting)。
磷酸化位点的预 测分析
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目录
1 什么是蛋白质磷酸化 2 磷酸化的意义 3 磷酸化位点的预测方法 4 相关数据库
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1.什么是蛋白质磷酸化
常见的蛋白质翻译后修饰过程有六种 , 如泛素化 , 磷酸化 ,糖基化 ,酯基化 ,甲 基化和乙酰化 ,其中磷酸化是蛋白质最重 要的翻译后修饰之一，是在一系列蛋白激 酶的作用下完成的，在酶和其它重要功能 分子活性的发挥、第二信使传递和酶的级 联作用中起到重要的作用。
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3.2.1.磷酸化位点预测系统
Net Phos K[BPG04][HSR04][BGB99] (http://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos K/) ； Pred Phospho[KLO04] (http://www.ngri.re.kr/proteo/Pred Phospho.htm) ； DISPHOS[IRB04] (/DISPHOS) ； GPS[ZXC04] (/gps/gps_web/) ； Kinase Phos[HLT05] (.tw/)。