磷酸化位点的预测分析
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。
我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。
应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。
两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。
蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。
在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。
蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。
目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。
毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。
生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。
是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。
近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。
这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。
ampk磷酸化位点
ampk磷酸化位点
AMPK (adenosine monophosphate-activated protein kinase) 是一
种重要的细胞能量传感器和调控器，它参与调节细胞的能量代谢和细胞生理过程。
AMPK被磷酸化后活化，磷酸化位点可
以分布在AMPK的α、β和γ亚基上。
AMPK的α亚基有两个磷酸化位点，分别是Thr172和Ser173。
Thr172位点的磷酸化是AMPK的主要激活机制，它使AMPK
形成一种活性构象，从而使其能够通过磷酸化下游靶蛋白来调节能量代谢。
Ser173位点的磷酸化则参与调控AMPK的稳定
性和亚基组装。
AMPK的β亚基和γ亚基都没有明确的磷酸化位点报道，但它们在AMPK复合物的形成和功能调节中起着重要角色。
β亚
基和γ亚基通过与α亚基相互作用，参与AMPK复合物的稳
定性和活性的调控。
总的来说，AMPK的磷酸化位点主要位于其α亚基上的
Thr172和Ser173位点，磷酸化将激活AMPK并调控其下游生
理过程。
蛋白的磷酸化和糖基化位点预测
百泰派克生物科技蛋白的磷酸化和糖基化位点预测蛋白质磷酸化和糖基化是常见的蛋白质翻译后修饰，能在一定程度上影响蛋白质的结构和生物学功能，使被修饰的蛋白质发挥特殊的调控功能。
蛋白磷酸化是在特异性蛋白激酶催化作用下，蛋白氨基酸残基共价结合三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP）的过程。
该修饰是可逆的，在蛋白磷酸酶的作用下，蛋白质可以发生去磷酸化。
蛋白磷酸化位点分析即鉴定蛋白质磷酸化发生在肽链的几号位氨基酸上以及发生在何种氨基酸上。
可通过磷酸酶法、串联质谱测序法等方法进行检测，其思路大致为将样品蛋白进行酶解，得到肽段混合物，然后特异性识别并富集发生磷酸化的肽段，再对该肽段的氨基酸序列进行分析，找出发生磷酸化的位点。
蛋白糖基化修饰在真核生物中非常普遍，几乎有一半以上的蛋白质发生了这种修饰。
蛋白糖基化一般发生在特定位点的氨基酸残基上，根据发生糖基化修饰的氨基酸位点以及结合的糖链类型，可以将糖基化修饰分为N-糖修饰、O-糖修饰以及糖基磷脂酰肌醇锚三类。
蛋白糖基化位点分析主要研究蛋白质在哪个氨基酸位点发生何种糖基化。
其大致的分析策略是先检测或确定糖蛋白的存在并对其进行富集分离；然后利用生物质谱结合蛋白酶或专一性糖苷内切酶的作用对收集的糖蛋白进行糖基化氨基酸位点鉴定，再将糖基化位点进行特异的质量标记使之与未发生糖基化的蛋白质之间存在一定的质量差异，通过质谱分析检测这些差异，进而通过串联质谱鉴定该糖基化修饰发生的氨基酸位点；最后进行糖链结构鉴定以确定发生的糖基化类型，这是整个鉴定工作中最难最复杂的一步，目前主要采用基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOF-MS）和核磁共振（NMR）技术进行研究。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，为广大科研工作者提供蛋白质糖基化位点检测一站式服务，只需要将您的需求告诉我们并寄送样品，百泰派克生物科技负责项目所有后续，包括蛋白提取、蛋白酶切、磷酸化或糖基化肽段富集、肽段分离、质谱分析、质谱原始数据分析、生物信息学分析所有事宜，并为您提供详细的中英文双语版技术报告。
生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
mapk蛋白磷酸化位点 解释说明以及概述
mapk蛋白磷酸化位点解释说明以及概述1. 引言1.1 概述MAPK蛋白是一类重要的信号转导分子，参与调控细胞内生物学过程。
作为MAPK蛋白的特殊位点，磷酸化位点在信号传导中起着关键作用。
本文旨在对MAPK蛋白磷酸化位点进行解释和说明，并概述其在细胞信号传导中的重要性。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分：引言、MAPK蛋白磷酸化位点、MAPK蛋白磷酸化位点的作用机制、应用和意义以及结论。
其中，引言部分将对文章的概述、结构和目的进行介绍。
1.3 目的本文旨在详细探讨MAPK蛋白磷酸化位点的定义、概念以及其在细胞信号传导中扮演的角色。
通过深入剖析MAPK蛋白磷酸化位点的作用机制和信号传导路径调控机制，我们将进一步了解其在生理和病理条件下所承担的功能。
此外，我们还将讨论MAPK蛋白磷酸化位点作为生物标志物的潜在应用前景以及其在药物靶向研究中的重要性。
最后，我们将总结本文的主要内容，并提出未来研究方向和展望MAPK蛋白磷酸化位点在临床应用中的前景。
通过本文的阐述，我们将能够更加全面地认识和理解MAPK蛋白磷酸化位点以及其在生命科学领域中的重要性。
2. MAPK蛋白磷酸化位点2.1 MAPK蛋白概述MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）是一类重要的信号转导蛋白激酶，在细胞内起着关键的调控作用。
它们参与调节许多重要生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和应激响应等。
MAPK家族包括ERK（Extracellular signal-regulated kinase）、JNK（c-Jun N-terminal kinase）和p38MAPK等亚家族，它们通过磷酸化底物蛋白来传递外界刺激信号。
2.2 磷酸化概念解释磷酸化是指在生物体内加入磷酸基团（PO4）3-到底物分子中的过程。
MAPK 蛋白的活性通常通过磷酸化机制来调节。
MAPK会被上游激活的激酶以级联反应的方式磷酸化，并进而转导信号到下游靶标分子，从而改变细胞内生理状态。
mapk蛋白磷酸化位点
mapk蛋白磷酸化位点
MAPK蛋白（Mitogen-Activated Protein Kinase）是一类广泛存在于细胞中的蛋白激酶，参与调控多种生物学过程，如细胞增殖、分化和细胞凋亡等。
MAPK蛋白通过磷酸化来活化下游信号传导的分子，这些磷酸化作用发生在特定的氨基酸残基上，这些残基就被称为MAPK 的磷酸化位点。
常见的MAPK磷酸化位点包括谷氨酸（Glutamate）的第183位以及亮氨酸（Tyrosine）和腺苷酸（Threonine）的第185、187位。
这些位点的磷酸化状态能够直接影响MAPK蛋白的活性，进而调控下游信号通路的激活和细胞功能的调控。
不同类型的MAPK蛋白存在于不同的细胞环境中，其磷酸化位点也可能有所差异。
常见的蛋白质磷酸化位点
常见的蛋白质磷酸化位点
蛋白质磷酸化是一种常见的后转录修饰方式，可以改变蛋白质的结构和功能。
在细胞信号传导和代谢调节等生物学过程中，磷酸化是一种重要的调节机制。
以下是一些常见的蛋白质磷酸化位点：
1. 丝氨酸磷酸化位点：丝氨酸是最常见的磷酸化位点之一，能够影响蛋白质的构象和功能。
2. 酪氨酸磷酸化位点：酪氨酸磷酸化常被用于调节酪氨酸激酶的活性，从而影响信号传导和细胞增殖。
3. 赖氨酸磷酸化位点：虽然赖氨酸磷酸化不太常见，但在某些蛋白质中也会出现，并被认为与细胞周期和增殖有关。
4. 鸟氨酸磷酸化位点：鸟氨酸磷酸化在很多生物过程中都发挥了重要功能，包括细胞凋亡、代谢调节和信号传导等。
以上是一些常见的蛋白质磷酸化位点，了解这些位点对于理解细胞信号传导和调节机制非常重要。
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蛋白丝氨酸磷酸化位点
蛋白丝氨酸磷酸化位点蛋白丝氨酸磷酸化位点是生物体内一种重要的生物化学反应，可以改变蛋白质的活性和功能。
它在细胞信号传递和代谢调节方面具有非常重要的作用。
本文将从以下几个方面对蛋白丝氨酸磷酸化位点进行简单阐述。
一、什么是蛋白丝氨酸磷酸化位点蛋白质磷酸化是一种常见的生物化学修饰方式，磷酸化位点即蛋白质上能够被磷酸化的位置，其中最常见的是丝氨酸和苏氨酸。
而丝氨酸磷酸化位点就是指蛋白质中丝氨酸被磷酸化后形成的位点。
二、蛋白丝氨酸磷酸化位点的生物学意义1. 信号传递和代谢调节细胞中的许多重要的生物学过程，如代谢、细胞周期等，都是通过键合特定的分子来传递信息的。
常见的分子键合方式包括磷酸化、酰化、甲基化等。
而蛋白质的磷酸化作为一个重要的分子键合方式，可以传递细胞内外的信号，从而调节许多代谢过程，有利于适应环境、维持生命体系的平衡。
2. 调节基因的表达蛋白丝氨酸磷酸化位点的变化可以调节基因的表达，从而影响细胞过程的发生。
例如，磷酸化酪氨酸激酶(Tyr)和磷酸化酪氨酸磷酸酯酶(TyrP)，可以通过对下游信号分子的磷酸化影响它们的活性，从而影响基因表达和细胞信号传递。
三、蛋白丝氨酸磷酸化位点的检测1. 磷酸化特异性抗体目前，最常用的方法是使用磷酸化特异性抗体来检测蛋白丝氨酸磷酸化位点。
磷酸化特异性抗体是根据要检测的磷酸化位点的具体序列设计的。
通过Western blot、免疫共沉淀等方法，可以检测磷酸化特异性抗体和目标蛋白是否结合，从而判断目标蛋白的磷酸化状态。
2. 质谱法除了使用磷酸化特异性抗体外，还可以采用质谱法进行检测。
通过质谱法，可以直接鉴定目标蛋白的磷酸化状态，确定其磷酸化位点的序列。
四、蛋白丝氨酸磷酸化位点的疾病1. 炎症性疾病许多炎症性疾病，如风湿性关节炎、肺炎等，都与蛋白质磷酸化有关。
在炎症反应中，磷酸化酪氨酸激酶(Tyr)和磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(MAPK)等蛋白都会发生改变，从而导致炎症反应的发生和加剧。
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(/xpd/xpd.htm) [WKK04]。
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4.1.Phosphosite
Phosphosite是由 CST(Cell Signaling Technology)开发的一个生物信息数据库。整合了 所有人类和老鼠体内磷酸化蛋白修饰位点信息， 这些信息包括修饰位点发布的参考文献、以修饰 位点为中心的多肽序列、定位于哪些已知的 domains和motif、研究这些位点所需的抗体来源、 以及一些相关链接。用户可以根据磷酸化蛋白质 名称、Swiss-Prot库中蛋白质ID、磷酸化修饰氨基 酸残基的名称和在蛋白质序列中的位置、提交者 姓名、CST编号、domains或motif、氨基酸序列来 查询磷酸化蛋白质。
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4.4. SWISS-PROT
SWISS-PROT数据库也是一个较常用磷酸化 蛋白质数据来源。它是由EMBL核苷酸序列库翻译 而来最齐全的注释精炼的蛋白序列库，最新版本 包含216380条蛋白质。在数据库的注释信息 Feature Tabel中可以查询到蛋白质修饰的相关信息， 其中MOD_RES项包含蛋白质发生的翻译后修饰的 名称、修饰位点等相关信息，磷酸化蛋白质修饰 位点信息可以通过此项查询到。
1.1.丝氨酸的磷酸化
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1.2.苏氨酸的磷酸化
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1.3.酪氨酸的磷酸化
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2.磷酸化的意义
蛋白质的磷酸化主要集中在肽链中的酪氨酸、 丝氨酸、苏氨酸残基上，这些残基上具有游离的 羟基，且本身不带电荷，当磷酸化作用后，蛋白 质便具有了电荷，从而使结构发生变化，进一步 引起蛋白质活性的变化，这也是蛋白质磷酸化的 意义所在。
磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式 之一，与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌 症机理等诸多生物学问题密切相关。
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2.1.蛋白质磷酸化的功能
1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为 反应性中间产物,如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依 赖的磷酸转移酶系统的组氨酸蛋白激酶;
2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激 酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基);
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4.3.Phosphorylation Site Database
Phosphorylation Site Database 数据库存放了原 核生物的磷酸化蛋白质。信息包含发布鉴定磷酸 化蛋白质位点信息的参考文献以及磷酸化蛋白质 的相关信息链接，如Pub Med，Gen Bank, SWISSPROT和PIR。可以通过物种种类、strain、蛋白质 名称、编码基因名称、修饰位点周围肽序列、 Phosphorylation Site Database编号来查询感兴趣的 磷酸化蛋白质。
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4.2.Phospho Base
Phospho Base是磷酸化位点预测算法普遍采用 的磷酸化蛋白质数据库。它整理的所有磷酸化蛋 白质修饰位点信息都是经过生物实验验证过的， 并且囊括了脊椎动物、昆虫、植物、细菌等多个 物种及人工合成的发生磷酸化修饰的蛋白。可以 通过蛋白质名称、激酶、结合motif进行查询。
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3.1.1. MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合
磷酸酯酶处理后,磷酸化的肽会丢失磷酸基团 而产生特定质量数的变化, MALDI-TOF-MS通过检 测这种质量数的变化而确定磷酸化位点。Larsen等 设计了一种可以直接在样品靶上进行肽混合物磷 脂酶处理的方法,并评价这种方法能准确鉴定磷酸 化位点,且在凝胶的带上或点上应至少有1 pmol蛋 白质存在。
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3.2.1.磷酸化位点预测系统
• Net Phos K[BPG04][HSR04][BGB99]
(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos K/) ；
• Pred Phospho[KLO04] (http://www.ngri.re.kr/proteo/Pred
3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细 菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。
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3.磷酸化位点的预测方法
• 试验检测 • 计算生物学技术
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3.1.试验检测
• Edman降解法 • MALDI-TOF-MS与磷酸酯酶处理相结合 • 源后裂解 • 基于MALDI-TOF-MS的其他分析方法 • 前体离子扫描 • 中性丢失扫描 • 逐级改变取样锥电势 • 31P检测 • 电子捕获解离
基于对数回归的线性分 类器
预测结果特征，二级结构预测结果特征，理化性质
特征，激酶种类
基于马尔科夫聚类算法
修饰位点邻近氨基酸序列相似度矩阵BLOSUM,激 酶种类
HMM模型
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
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3.2.1.主要的机器学习算法
• 人工神经网络( Artificial Neural Netw o rk , ANN) ； • 支持向量机( Suppo rt Vecto r M achine , SVM) ； • 隐马尔可夫模型( Hidden M arkov M odel , H M M) ； • 对数比回归模型( logistic reg ressio n m odels) ； • 位置特异得分矩阵( position -specific scoring m atrix ,
丢失 ,且因其负电性而难于质子化 。
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4.相关数据库
• 1.Phosphosite (/)
[HCK04] ；
• 2.Phospho Base
(http://www.cbs.dtu.dk/databases/Phospho Base/) [KBB99] ion -Entropy)； • 贝叶斯决策理论( Bayesian decision theo ry , BDT) ； • 加权投票( weig hted vo ting)。
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3.3.蛋白质磷酸化位点分析的困难
• 蛋白质磷酸化在体内是一种不稳定的动态过程 ; • 磷酸化蛋白质在细胞内丰度较低 ; • 磷酸化蛋白质的磷酸基团很容易在分离过程中
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3.2.2.预测系统所采用的方法
系统名称 NetPhosK PredPhospho
DISPHOS
GPS KinasePhos
现有预测磷酸化位点系统所采用的方法
方法
提取的特征
神经网络
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
SVM
修饰位点邻近氨基酸序列特征及激酶种类
修饰位点邻近氨基酸序列特征，蛋白质disorder
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1.什么是蛋白质磷酸化
指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到 底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸）上的过程，或者在信号作用下结合GTP，是 生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导 的过程中起重要作用。
某个信号蛋白磷酸化通常造成下游的蛋白依 次发生磷酸化，形成磷酸化级联反应。
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Phospho.htm) ；
• DISPHOS[IRB04] (/DISPHOS) ； • GPS[ZXC04] (http://973-
/gps/gps_web/) ；
• Kinase Phos[HLT05] (.tw/)。
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Thank you
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磷酸化位点的预 测分析
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目录
1 什么是蛋白质磷酸化 2 磷酸化的意义 3 磷酸化位点的预测方法 4 相关数据库
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1.什么是蛋白质磷酸化
常见的蛋白质翻译后修饰过程有六种 , 如泛 素化 , 磷酸化 ,糖基化 ,酯基化 ,甲基化和乙酰 化 ,其中磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之 一，是在一系列蛋白激酶的作用下完成的，在酶 和其它重要功能分子活性的发挥、第二信使传递 和酶的级联作用中起到重要的作用。