柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性

柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性孙大光1,2，郑雪芳2，刘波2 ，阮传清2，范国成2，夏育陆3，Hall D.4，段永平4（1福建师范大学生命科学学院，福州350108；2福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心，福州350003；3美国北卡州立大学有害生物综合治理研究中心, 美国；4美国农业部佛罗里达园艺试验室，弗罗里达34945）摘要：对红心柚、蜜桔、金桔内生细菌进行分离鉴定并做多样性分析，为研究柑橘内生细菌与柑橘病害的生物防治奠定基础。

平板分离法分离柑橘不同器官内生细菌，采用美国MIDI微生物鉴定系统鉴定菌株，对内生细菌数量进行统计、分类，并作群落多样性分析。

3种柑橘共分离得到的内生细菌属于32个种，隶属于17个属。

红心柚、蜜桔、金桔分别分离得到内生细菌10个属13个种，14个属22个种，12个属21个种。

不同种类细菌中芽孢杆菌属细菌含量最高，3种柑橘中金桔的内生细菌含量最高，不同器官中根部的内生细菌含量最高。

柑橘内生细菌进行聚类分析表明，。

在不同柑橘和不同器官中内生细菌的种类、数量和群落多样性存在较大差异。

蜜桔叶片内生细菌的SIMPSON（D）指数最高；蜜桔叶片内生细菌的SHANNON（H1）指数最高；蜜桔根部内生细菌Pielou指数最高。

本研究丰富了柑橘内生细菌资源，为柑橘内生细菌的利用提供了物质基础，并对科学说明生防作用机理具有重要价值。

关键词：柑橘内生细菌PLFA多样性分布S eparation, identification and distribution of endophytic bacteria in citrusSUN Da-guang1，2，ZHENG Xue-fang2，LIU Bo2*,RUAN Chuan-qing2, FAN Guo-cheng2, XIA Yu-lu3, Hall D.4, DUAN Yong-ping41. College Of Life Science Fujian normal university, Fuzhou 350108, China;2.Citrus Huanglongbing Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China；3. The Center of Integrated Pest Management, North Carolina State University, North Carolina, USA；4. Horticultural Research Laboratory (USDA/ARS), Florida, 34945, U.S.AAbstract: In order to ascertain the connection between citrus endopphytic bacteria and the Biological control about citrus Disease, the study on the citrus endophyte’s number, bacteria’s identification and community multiplicity analysis were conducted. The endophytic bacteria were isolated using the culture method and identified by Microorganism Identification System (MIDI system produced by USA). 32 microbial species identified belonging to 17 genera of bacteria were detected from endophytic bacteria in Citrus grandis Osbeckcv, Chinese honey orange and Cumquat. The content of Bacillus was the most in all endophyte, Cumquat’s endophyte was the most among 3 these citrus and the number of endophytic bacteria in root was more than other organs. The cluster analysis results showed that 32 strains could be separated into 7 groups. The community multiplicity and diversity of endophytic bacteria were significant different in 3 different citrus.Keyword：citrus；endophytic bacteria；PLFA；community multiplicity柑橘是世界第一大果树品种，全球有135个国家和地区生产柑橘，2008年我国成为世界柑橘第一大国[1, 2]。

柑橘不仅仅口味宜人而且本身具有很多功能性物质，可广泛应用于功能性食品的开发、药物的开采及一些功能性饲料的研制等[3]。

内生细菌（endophytic bacteria）是指从经过表面消毒植物组织分离得到并不会对植物本身造成实质性伤害，而且在一定的程度上还会与植物建立和谐关系的细菌[4, 5]。

其对植物的作用表现在很多方面，如有些内生细菌可以产生植物激素促进植物生长[6]，有些促进植物生物固氮作用[7]，有些可以产生抗生素增加植物对抗病原菌和外来寄生虫的抵抗能力[8]。

了解内生细菌与植物生长之间的关系，并且能够将这些关系应用到农业生产、保护生物多样性以及保持农业生态平衡具有重要的意义[9]。

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项(No.201003067-05)；中美合作项目-柑橘木虱及黄龙病野外研究(No.2010-1652-02)、抗虫柑橘品种研究（No.6618-22000-037-01S）；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（No.STIF-Y03）作者简介：孙大光（1987—），男，硕士研究生.，主要从事植物内生菌的研究，E-mail：woshisdg@*通讯作者（责任作者）：刘波（1957—），男，博士，研究员，从事微生物生物技术与农业生物药物研究，E-mail：liubofaas@自1866年De Bary将生活在植物组织内的微生物与植物表面的微生物相区别以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛关注[10]。

据不完全文献统计，目前已从甜菜[11]、牧草[12]、小麦[13]、水稻[14]、马铃薯[15]等近30种植物中分离了近60个属的内生细菌[16]。

罗永兰等从柑橘植株中分离得到多种内生细菌[17]。

张翼等从柑橘枝条中分离得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )YS45菌株对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)具有拮抗作用[18]。

Araújo等[19]从甜橙中分离得到短小杆菌（Curtobacteria flaccumfaciens）可以抑制柑橘杂色褪绿病(Citrus Variegated Chlorosis,CVC)菌(Xyllela fastidiosa)的生长。

目前对柑橘内生细菌的研究主要集中在内生菌的分离、鉴定、生物防治、促生因子、抑菌活性物质分析等方面[17, 20]，而国内外对柑橘内生细菌群落结构的研究比较少见。

本研究采用美国MIDI微生物鉴定系统对不同品种柑橘植株分离的内生细菌进行鉴定，了解内生细菌在柑橘植株不同品种和不同部位的分布特性，为柑橘内生细菌相互关系的研究和内生细菌资源开发利用奠定基础。

1材料与方法1.1材料供试的柑橘植株为2010年7月23日在顺昌北门水库边赵氏园艺技术研究所果树基地采集的3个柑橘品种，分别为红心柚（Citrus grandis Osbeck cv.Chander），蜜桔（Citrus unshiu Marc）和金桔（Fortunella margarita （Lour.）Swingle）。

采集方法，选择一株具有典型黄龙病病症的红心柚（Citrus grandis Osbeck.Chandler），分别从植株东面、南面、西面、北面取其上部、中部、下部共12个部位叶片、枝条及其根部。

将供试材料立即带回实验室并进行处理。

NA培养基、TSB培养基、脂肪酸提取处理试剂、气相色谱系统、分析软件、均参考蓝江林等[21]的方法。

试剂：甲醇，正已烷甲基叔丁基乙醚（fisher公司），盐酸，氢氧化钠（优级纯），脂肪酸混合标样（C9至C20），去离子水。

1.2方法1.2.1柑橘内生细菌的分离与数量统计分别称取叶片5g，首先将叶片用自来水冲洗干净，吸干叶片表面的水，在75%酒精里浸泡30s，接着用10%次氯酸钠浸泡5分钟，再用无菌水漂洗叶片3次。

为了检验表面灭菌的效果，用灭过菌的镊子夹着叶片是叶片表面与NA平板接触2min然后放在30℃培养2d，若发现平板上没有菌落出现，证明该叶片表面灭菌彻底，改样品得到的结果可信，否则该分离结果不能使用。

无菌操作将叶片剪碎至于研钵里并加入45mL无菌水，充分研磨匀浆制成10-1样品原液，静置30min。

依次将原液稀释至10-2，10-3，取200µL加到NA平板上，涂布至平板干燥，试验重复3次。

将涂布后的NA 平板至于28℃的培养箱培养24h，观察菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿状态等特征。

.挑取各部位具有代表性的单菌落，并计数、纯化、20%甘油-80℃保存分离得到的菌株。

根据内生细菌菌落形态结构等特征，对不同柑橘植株和不同器官中内生细菌出现的数量进行统计。

内生细菌含菌量（cfu·g-1FW）即每克柑橘鲜重组织经培养后产生的菌落个数。

1.2.2细菌种类鉴定（脂肪酸鉴定法）细菌鉴定通过美国MIDI公司开发的全自动微生物鉴定系统Sherlock MIS鉴定，脂肪酸提取，脂肪酸的检测参考蓝江林等方法[21]。

1.2.3柑橘内生细菌的聚类分析参考车建美等[22]方法，以分离到的内生菌菌株为样本，以各菌株在不同柑橘器官中的含量指标，组成数据矩阵，将所得数据输入DPS 7.05数据处理系统，采用马氏距离为聚类尺度，以类平均法对数据进行系统聚类分析，并自动生成各供试菌株的聚类图和相异系数表。