等电点电泳 原理 步骤 详细
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点
实验三十五IEF电泳测定蛋白质等电点等电点(isoelectri。
point)是蛋白质的最重要理化性质之一，其定义是当蛋白质的酸性解离与碱性解离趋势相等，蛋白质分子的净电荷为零时，环境的pH。
当蛋白质分子的pI<环境pH时带正电荷向负极移动，pI>环境pH时带负电荷，向正极移动，处于等电点时的蛋白质在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动。
每一种蛋白质都有一个特定的等电点，测定蛋白质的等电点最为普遍采用的方法是等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)电泳，IEF是60年代建立起来的一种蛋白质分离分析手段，其分辨率高，可达0．001pH单位，且操作方便、迅速，因此除用于蛋白质等电点测定外，也常被用于蛋白质纯度鉴定及分离制备蛋白质，是生物化学、分子生物学、遗传学等研究中的重要分离、分析方法。
实验原理等电点聚焦电泳的基本原理是通过在凝胶中加入载体两性电解质，使其在电场作用下，从阳极到阴极形成一个连续而稳定的线性pH梯度，其正极为酸性，负极为碱性，通常使用的载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸化合物，其在电泳中形成的pH梯度范围有3～10，4～6，5～7，8～10等，蛋白质在IEF电泳时，当样品置于负极端时，因pH>pI，蛋白质分子带负电荷，电泳时向正极移动，在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷逐渐减少，蛋白质分子移动的速度逐渐变慢，当移动到pH=pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动而聚焦成带。
当蛋白质置于正极时，也会获得同样的结果。
因此在进行IEF电泳时，样品可以置于任何位置。
由于各种不同蛋白质的氨基酸组成不同，因而有不同的等电点，在IEF电泳时，会分别聚焦于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带。
在IEF电泳中蛋白质区带的位置是由电泳pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小及形状无关。
因此根据蛋白质区带在pH梯度中的位置便可测得该蛋白质的等电点。
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF ）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH 梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH 梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH 梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0 的区带，这时的pH 则是该分子的pI ，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH 环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI 迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI 处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M 磷酸（阳极液）、1M 氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R—150溶于300ml脱色液中，加热到60 - 70C,加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100 、9M 尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF 样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF 样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2, 制模具：洗干净两块IEF 专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml 胶母液（10％，19/1）6—8 ％尿素1ml Ampholine （pH3.5-10）60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
电泳技术基本原理和步骤
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)
图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱 Ag：抗原；1、2、3为待测标本；4、5、6为标准
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)－－检验医学中的应用
– 火箭电泳放射自显影定量甲胎蛋白
图 6-17 火箭电泳放射自显影定量检测AFP图谱
蛋白质分子为两性电解质 等电点 pH>等电点 带负电 pH<等电点 带正电
基本原理
质点所带净电荷量越多（介质的pH值离等电点越远） 质点的直径越小 越接近球形 则它在电场中的泳动速度越快，迁移率亦越大。
区带电泳
• 检验医学中的应用－－血清蛋白电泳
Alb：清蛋白 α1：α1酸性糖蛋白、α1抗胰蛋白酶 α2：HP、CP、α2巨球蛋白、α脂蛋白 β：运铁蛋白、补体系统、β脂蛋白 γ：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE
电泳技术基本原理和步骤
目录
• 第一节 • 第二节 • 第三节 • 第四节 • 第五节 • 第六节 • 第七节 • 第八节
区带电泳 等电聚焦电泳 SDS-PAGE电泳 二维电泳 印迹技术 免疫电泳 高效毛细管电泳技术 电泳分析仪
基本原理
不同性质的质点，由于带电性质及电量不同，在 一定电场强度下移动的方向和速度亦不同。
第四节 二维电泳
• 检验医学中的应用
一个问题：如何确定某个条带 是什么蛋白质？
图 6-1 正常血清蛋白电泳图谱 上图：箭头示电泳方向，右侧示各条带的主要组分； 下图：光密度扫描后电泳图谱；HP：触珠蛋白；CP：铜蓝蛋白
第五节 印迹技术
• 免疫印迹法－－基本原理
图 6-13 免疫印迹法的原理
第五节 印迹技术
生命科学中的等电点电泳技术分析
生命科学中的等电点电泳技术分析生命科学是一门高深的学科，它涉及的领域异常广泛，如生物化学、分子生物学、遗传学等等，在这些领域中，等电点电泳技术分析是一项颇具地位的技术。
等电点电泳技术（Isoelectric focusing, IEF）是一种通过电荷差异来分离、纯化和定量蛋白质的技术。
根据其原理，等电点电泳是一种在等电点或等电位点上蛋白质带电量与溶剂背景电场平衡的电泳分离技术。
等电点电泳具有高分辨率、高通量、低样品要求等特点，成为了蛋白质组学的重要技术之一。
等电点电泳技术原理背后的基本概念是，蛋白质在水中溶解后带有正或负电荷，这是由离子化的基团带来的，该基团正电荷与负电荷之比决定了蛋白质的等电点电位。
等电流去除了电极之后，蛋白质分子如同漂浮在电场之中，直到到达其等电位。
当蛋白质分子到达它的等电点电位，它们会被欧姆定律的规律所吸引，停止在那个位置，停留时间取决于酸碱性和离子交换能力。
在实验操作方面，等电点电泳技术通常包括两种基本类型，非定向和定向。
其中，非定向等电点电泳将试样因离子强度差异与pH梯度进行分离，通过染色后观察试样中蛋白质的增强或消失实现检测；而定向等电点电泳依据蛋白质分子等电点电位分布特异性地选择性分离，从而实现高品质、高效率的蛋白质分离。
在标本操作方面，等电点电泳技术需要注意几件事情。
首先，标本区域应该在斜标本板或垂直标本板中。
其次，标本应该由远及近，由深至浅地添加。
最后，在进行等电点电泳之前应该将凝胶缓冲液平衡等化。
等电点电泳技术一般用于酸性、中性和碱性的蛋白质分离，而且不需要蛋白质样品特性有任何改变。
例如：等电点电泳可以在血液和组织样本中检测神经特异性、蛋黄天冬氨酸转移酶等酶的活性。
它可以在血清和其他天然液体的水平上检测静脉血液中的人类血清白蛋白（HSA），这是一种广泛用于癌症、肾脏病、糖尿病和心血管病的生物标志物。
等电点电泳技术还可应用于蛋白质芯片和鉴别蛋白质，例如：P50-2（一种结构紧密而富含丝氨酸和脯氨酸的蛋白质）和一种基于抗体的蛋白质。
等电点聚焦电泳
等电点聚焦电泳等电点聚焦电泳（Isoelectric Focusing，简称IEF）是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
它基于蛋白质在特定条件下在电场中的移动速度与其等电点相关的原理，能够将混合蛋白质样品分离成不同的带状区域，从而实现对蛋白质的纯化和分析。
等电点是指蛋白质在电场中呈等电状态的pH值。
蛋白质在不同的pH值下带有正电荷或负电荷，当蛋白质的等电点与运行缓冲液的pH值相等时，蛋白质净电荷为零，停止运动。
这时，蛋白质会聚焦在等电点处，形成锐利的带状区域。
在进行等电点聚焦电泳实验时，先将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶中存在着一种称为聚丙烯酰胺的高分子物质，它能够提供电泳的通道。
然后，在两端施加电场，使蛋白质在凝胶中向两极运动。
同时，凝胶中的pH值梯度能够使蛋白质在移动过程中逐渐接近其等电点，最终停留在等电点处。
等电点聚焦电泳的优势在于能够分离各种不同等电点的蛋白质，从而实现高分辨率的蛋白质分析。
它可以用于研究蛋白质的异构体、修饰和突变等信息，对于蛋白质组学研究、生物药物的质量控制等具有重要意义。
在等电点聚焦电泳中，pH梯度的建立是关键步骤之一。
常用的方法包括使用缓冲液体系和添加胶体等。
缓冲液体系可以通过选择不同的酸碱成分和浓度来调节pH梯度的范围和形状；而添加胶体则能够改变凝胶中的离子浓度分布，从而调节蛋白质的电泳速度。
等电点聚焦电泳的结果可以通过染色或质谱等方法进行检测和分析。
染色方法可以使用酸性、碱性或中性染料，如银染色、Coomassie 蓝染色等，以可视化蛋白质的带状区域。
质谱分析则可以进一步确定蛋白质的分子量和序列等信息。
除了等电点聚焦电泳，还有其他一些蛋白质分离和分析技术，如SDS-PAGE、凝胶过滤层析、离子交换层析等。
这些方法在不同的情况下可以互补使用，以实现更全面的蛋白质分析。
等电点聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点的分离和分析技术。
它通过建立pH梯度，在电场中将蛋白质聚焦在等电点处，实现高分辨率的蛋白质分离。
电泳技术的原理和过程
电泳技术的原理和过程电泳技术是一种将带电的微粒或者溶解物通过电场力作用进行分离的方法。
它利用了带电粒子在电场中移动的性质，根据粒子的电荷量、大小和形状的不同，使其分离。
电泳技术的原理基于两个基本原理：电场力和迁移率。
1. 电场力：当带电粒子置于电场中时，电场力作用在粒子上。
这个电场力的大小与带电粒子的电荷量成正比，与电场强度成正比，反向与带电粒子的电荷极性一致。
电场力越大，粒子运动速度越快。
2. 迁移率：带电粒子在电场中的速度也受到其自身性质的影响，即带电粒子在电场中的迁移速率。
迁移率与带电粒子的电荷量、形状和大小有关。
一般来说，带电粒子的迁移率越大，移动速度越快。
基于以上原理，电泳技术的过程包括以下几个步骤：1. 准备样品：将希望分离的样品溶解在电泳缓冲液中，通常是一种带有电解质的缓冲液。
2. 准备电泳设备：将准备好的样品放置在电泳槽中。
槽中的电极接通电源，形成一个电场。
通常，阳极放在电泳槽的末端，而阴极则放在靠近样品的一端。
3. 操作电泳条件：设置适当的电场强度和时间，以保证带电粒子能够在合适的时间内得到分离。
强度太弱会导致分离时间过长，强度太大则可能会破坏分离过程。
4. 进行电泳：开启电源，使电场开始作用。
带电粒子在电场作用下迁移到相应的位置。
正电荷物质向阴极方向迁移，负电荷物质则向阳极方向迁移。
5. 结果分析：根据分离的结果，可以通过各种检测方法来确定目标物质的位置和含量，例如使用染色剂或者检测器。
总的来说，电泳技术通过利用电场力和迁移率的原理，将带电粒子分离开来，实现了分析和纯化的目的。
这种技术在生命科学、生物医学、环境分析等领域有着广泛的应用。
等电聚焦电泳的原理和应用
等电聚焦电泳的原理和应用1. 原理等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点（pI）差异的分析方法。
在等电聚焦电泳中，蛋白质被置于一个电荷梯度进行分离，直到达到其等电点时停止运动。
原理可分为以下几个步骤：1.1 准备电荷梯度电荷梯度是等电聚焦电泳中的关键。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶，其中有两个极性的电解质进行稀释，创建一个pH梯度。
这个梯度会在凝胶中生成氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-）。
1.2 样品加载样品通常会混合在一种称为“载体溶胶”的缓冲液中，以保持样品的pH稳定。
这些样品会在载体溶胶上浮，准备好进行电泳分离。
1.3 离子迁移一旦样品加载完成，电泳过程就开始了。
在电场的作用下，蛋白质在电荷梯度中迁移。
1.4 等电点停止当蛋白质在凝胶中达到其等电点时，它们的净电荷为零，停止迁移。
等电点是蛋白质的理论中性点。
2. 应用等电聚焦电泳在生物医学和生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些应用示例：2.1 蛋白质分离和纯化等电聚焦电泳常用于蛋白质的分离和纯化。
通过优化电荷梯度和其他实验条件，可以实现对复杂样品的高分辨率分离。
这种方法对于深入了解蛋白质的结构和功能非常有帮助。
2.2 蛋白质组学研究等电聚焦电泳在蛋白质组学研究中发挥重要作用。
通过等电聚焦电泳，可以分析和比较不同样品中蛋白质的表达水平。
这对于研究疾病相关蛋白质的变化以及寻找生物标志物非常重要。
2.3 药物分析等电聚焦电泳在药物分析中也有应用。
它可以用来研究药物-蛋白质相互作用和药物的释放动力学。
这对于药物的开发和优化具有重要意义。
2.4 食品分析等电聚焦电泳在食品分析中也得到了广泛应用。
它可以用来检测食品中的蛋白质含量和质量，包括检测过敏原和添加剂。
这对于食品质量和安全性的监测非常重要。
3. 结论等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点差异的分析方法。
它在分离和纯化蛋白质、蛋白质组学研究、药物分析和食品分析等领域都有广泛的应用。
这种方法具有高分辨率和灵敏度，对于研究生物分子在不同条件下的特性具有重要意义。
第七章、等电聚焦电泳技术
二、载体两性电解质
• 稳定的 梯度是等电聚焦技术的关键； 稳定的pH梯度是等电聚焦技术的关键 梯度是等电聚焦技术的关键； • 特殊的两性电解质可以实现pH梯度。 特殊的两性电解质可以实现 梯度。 梯度 两性电解质：同时带有正、 两性电解质：同时带有正、负电基团的化合 物。
1. 载体两性电解质必需具备的条件
第六章、 第六章、等电聚焦电泳技术
等电聚焦（ 等电聚焦（isoelectrofocusing, IEF or EF)： ： 等电点聚焦就是在 电场中形成一个由阳极 到阴极逐步增加的pH梯 到阴极逐步增加的 梯 度，不同的蛋白质移动 并聚焦于与其等电点相 当的pH位置上 位置上， 当的 位置上，从而达 到蛋白质的分离目的。 到蛋白质的分离目的。
–聚丙烯酰胺凝胶使pH向阴极漂移 聚丙烯酰胺凝胶使pH向阴极漂移 聚丙烯酰胺凝胶使pH –琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约2个pH单位 琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约2 pH单位 琼脂糖凝胶可使pH向阴极漂移约
四、pH梯度的选择 pH梯度的选择
• 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体， 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体， pH3 的载体 经初步测定后改用较窄的以提高分辨率; 经初步测定后改用较窄的以提高分辨率; • 在使用pH7以上或以下范围时，因缺少中性 在使用pH7以上或以下范围时， pH7以上或以下范围时 载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7 载体，在聚焦过程中载体与电极之间在pH7 部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低， 部位就会形成纯水区带，纯水的电导极低， 必须避免此现象。凡使用离开中性的pH pH范围 必须避免此现象。凡使用离开中性的pH范围 的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6 0.1载体量的pH6的载体时应加入相当于0.1载体量的pH6-8或 pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时，可 pH3-10的载体。在用pH低于3的范围时， 的载体 pH低于 加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸， 加有机酸如一氯醋酸，二氯醋酸，甲酸，乙 pH离于10时 可补加胺使pH增加到11 离于10 pH增加到11。 酸，pH离于10时，可补加胺使pH增加到11。
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当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳 极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不 同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点 位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。
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讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外 在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的 是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化
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由于载体两性电解质(carrier ampholytes)是一 系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的， 设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的 pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。
干扰样品的测定。
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2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB） 本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多氨基
多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又 十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH3~10
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3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是一系列 不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它 们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度 (pH gradient)。
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二、IEFE的特点
（一）优点
• High Resolution • High Sensitivity • Good Reproduction
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（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
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分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别 适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同 而电荷(electric charge)不同的生物大分子。
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1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的
缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不
b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
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在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场 中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带 上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动， 迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即 被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .
ห้องสมุดไป่ตู้
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在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形成 一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH 梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。
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蛋白质分子的电聚焦过程
+ pH=pI
-
pI1
pI2
+
pI3
pIn
a
b
c
—
a. 蛋白质分子在负极端
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㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解 质(Carrier ampholytes) 分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电 的基团数目相等，净 电 荷 (net charge) 为 零。
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㈡引入电场时的变化 载 体 两 性 电 解 质 (carrier ampholytes) 分 子 将 向 阴 极 (cathode)或阳极(anode)迁移， 带有最低等电点的分子（荷 最多的负电）将最快地向阳 极迁移。当它达到净电荷是 零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电 解质分子（荷其次多的负电） 也将向阳极移动，直到它的 净电荷被减少到零才停止。
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㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质
(carrier ampholytes)分子 以增加pI级数的办法将分 别在阳、阴极之间到达它 们自己的位置而给出一个 pI梯度。
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电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
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等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是在电泳
Q M = ——
6r
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讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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三、IEFE的基本原理
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蛋白质分子在不同pH下的解离状 态
NH3+
P
P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 COO-
pH＜pI pH＝pI pH＞ pI
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
李莉
1
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讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电 点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质的电泳 技术。
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进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
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（一）pH梯度的建立
用 多 种 两 性 电 解 质 (ampholytes) 混 合 物 建 立 稳 定良好的pH梯度