酶工程期中思考题参考答案

1. 举例说明酶催化的绝对专一性和相对专一性。

绝对专一性：具有绝对专一性的酶仅作用于一种底物，催化一种反应。

例如脲酶只能催化脲（又称尿素）水解成氨和二氧化碳，而对尿素的氯或甲基取代物都无作用。

相对专一性：有些酶的专一性较低，它们能作用于一类化合物或一类化学键。

这种专一性称为相对专一性。

其又可分为族类专一性（或称基团专一性）和键专一性，前者对底物化学键两端的基团有要求。

例如α-D-葡糖苷酶作用于α-糖苷键，并要求α-糖苷键的一端必须有葡糖基团。

因此，它可催化蔗糖和麦芽糖水解。

键专一性只作用于一定的化学键，而对键两端的基团无严格要求，如酯酶可使任何酯键水解。

例子不唯一，尽量不要相同
第二版：P3-P5
第三版：P3-P4
2. 酶的生产方法有哪些？用于酶生产的微生物应具有什么特点？
酶的生产方法主要有提取分离法，生物合成法和化学合成法等。

产酶微生物应具有的特点有：
1.酶的产量高:通过筛选获得高产菌株，妥善保存并定期复壮
2.容易培养和管理:对培养基成分和工艺条件没有苛刻的要求，适应能力强
3.产酶稳定性好:能稳定生长并表达所需的酶，菌种不易退化
4.有利于酶的分离纯化:酶的分离提纯要比较容易，能获得较高纯度
5.安全可靠:菌种对环境及对操作人员安全，不产生不良影响
第二版：P22-P25
第三版：P20-P22
3. 固定化细胞发酵产酶具有哪些特点？
固定化细胞发酵产酶的特点有：
1.提高酶的产率：细胞固定化滞后，单位空间内细胞密度增大，因此加速了生化反应；
2.可以反复使用，可以在高稀释率下连续发酵；
3.提高基因工程菌质粒的稳定性；
4.固定化细胞对pH值、温度等外界条件的适应范围增宽，对抑制剂的耐受能力增强，因此发酵稳定性好；
5.可先经预培养再转入发酵生产，缩短发酵周期，提高设备利用率
6.固定化发酵是非均相体系，产品容易分离纯化
7.一般只适用于胞外酶的生产
第二版：P68-P70
第三版：P57-P58
4. 概述酶生物合成模式及每种模式的生物学特征，并写出产酶动力
学方程并根据酶生物合成模式讨论之。

根据酶产生与细胞生长的关系酶的生物合成模式可分为4类：
⑴同步合成型
①酶的生物合成与细胞生长同步进行（生长偶联型）
②大部分组成酶属于此类
③此类酶的合成可由其诱导物诱导生成，不受分解代谢物阻遏和反馈阻遏作用
④酶对应的 mRNA 很不稳定
典型例子：米曲霉培养生产单宁酶 [EC 3.1.1.20]（书p36 图2-8）
⑵延续合成型
①酶的合成伴随着细胞的生长而开始，生长进入平衡期后，酶还能延续合成一段时间
②此类酶的合成可被诱导物所诱导，一般不受分解代谢物阻遏
③此类酶所对应的 mRNA 稳定性好
举例：黑曲霉培养生产聚半乳糖醛酸酶 [EC 3.2.1.15]（书p37 图2-9）
⑶中期合成型
①酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随之停止
②酶的合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用
③酶所对应的 mRNA 稳定性较差
举例：枯草杆菌碱性磷酸酶 [EC 3.1.3.1] 受其水解产物磷酸的反馈阻遏作用（书p38 图2-10）
⑷滞后合成型
①当细胞生长一段时间或进入平衡期后，才开始合成并大量积累酶
②许多水解酶属于此类
③阻遏物的存在延缓了酶的合成
④此类酶的 mRNA 稳定性好
举例：黑曲霉酸性蛋白酶 [EC 3.4.23.6] （书p38 图2-11）
4种模式对应的酶合成曲线如下图所示：
产酶动力学方程为：()=
=+⋅E
R αμβX t
E d d 各种产酶模式下的宏观动力学方程 ⑴同步合成型：β = 0，则
=E
αμX t d d
⑵ 中期合成型：特殊的生长偶联型， β = 0 有阻遏存在时，α =0，无酶产生
=E t d 0d
阻遏解除后才开始合成酶，此时
=E
αμX t d d
⑶滞后合成型：非生长偶联型，α = 0，则
=E
βX t d d
⑷延续合成型：部分生长偶联型，α ≠ 0，β ≠ 0
=+E
αμX βX t d d
第二版：P60-P64,P66-P67 第三版：P35-P39，P54-P55
5. 以大蒜细胞培养生产SOD 为例，
简述植物细胞培养产酶的工艺过
程。

大蒜细胞培养产SOD过程如下：
大蒜愈伤组织的诱导
选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮
先用70% 乙醇消毒20 s，再用0.1%升汞消毒10 min，然后无菌水漂洗3次
在无菌条件下，切成0.5 cm3 的小块，植入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的半固体MS 培养基中
25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下培养18天，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次
大蒜细胞悬浮培养
将上述在半固体MS 培养基上培养18天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3 mg/L 2,4-D 和1.2 mg/L 6-BA 的液体MS 培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养10～12天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞
无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3 mg/L 2,4-D和1.2 mg/L 6-BA 的液体MS 培养基中，25 oC，600 lux，12 h/d光照条件下振荡培养18天
SOD 分离纯化
收集细胞，破碎，用pH 7.8 磷酸盐缓冲液提取
第二版：P86-P87
第三版：P77
6. 对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素与注意事项？
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团
①pH与离子强度：决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态
②修饰反应的温度与时间：严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应
③反应体系中酶与修饰剂的比例: 控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失
7. 简述酶的金属离子置换修饰过程。

酶的金属离子置换修饰过程主要包括如下步骤：
⑴酶的提纯
⑵除去原有金属离子
加入金属螯合剂，如EDTA 等，让酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物
透析、超滤或层析除去螯合物
⑶加入置换的离子
加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合
用透析或层析等方法除去未结合的离子
第二版：P155
第三版：P137
8. 列出酶分子侧链修饰时可和修饰剂结合的功能基团，以及所对应
的氨基酸。

①氨基（—NH2）：氨基在酶蛋白中主要是Lys 的ε-NH2 和肽链末端氨基
②羧基（—COOH）：羧基在酶蛋白中主要是Asp 和Glu 的侧链—COOH，以及肽链的末端羧基
③巯基（—SH）：巯基在酶蛋白中主要是Cys 的β-SH
④胍基（—N=C(NH2)2）：胍基存在于酶蛋白的Arg 残基侧链上
⑤酚基和羟基（—OH）：酶蛋白中含羟基的氨基酸残基有：Ser、Thr、Tyr
⑥咪唑基：咪唑基存在于酶蛋白的His 残基侧链上
⑦吲哚基：吲哚基存在于酶蛋白的Trp 残基侧链上
⑧甲硫基：酶蛋白中Met 残基中的硫以硫醚的形式存在
⑨分子内交联：采用双功能基团化合物（双功能试剂），在酶分子中对空间距离较近的两个氨基酸残基侧链基团之间进行共价交联
第二版：P161-P165
第三版：P142-P145
9. 举例说明肽链有限水解修饰的作用。

在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生精细改变，从而改变酶催化特定的修饰方法，称为肽链有限水解修饰。

有些生物体可以通过生物合成得到不显示酶催化活性的酶原，利用具有高度专一性的蛋白酶对其进行肽链有限水解修饰，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，就可以使其空间结构发生某些精细的改变，有利于活性中心与底物结合并形成正确的催化部位，从而显示出酶的催化活性或提高酶活力。

例如,胰蛋白酶原本来没有催化活性，当受到胰蛋白酶原或肠激酶的修饰作用，从N-端切除一段六肽序列N-Val—(Asp)4—Lys后，就显示胰蛋白酶的催化功能。

有些酶的活性较低，通过酶分子主链修饰可以显著提高酶的催化活性。

例如，天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基端切除10个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5倍左右。

第二版：P166-P167
第三版：P146-P147
10. (1) 写出聚乙二醇的三氯均三嗪法修饰酶氨基的反应方程式；
(2) 写出碳化二亚胺选择性修饰酶分子羧基的反应方程式；
(3) 写出三硝基苯磺酸（TNBS）修饰肽链残基上氨基的反应式；
(4) 写出DTNB（Ellman）试剂修饰巯基的反应式；
(5) 写出丁二酮修饰精氨酸胍基的反应式。