3-高效液相色谱分析d3(精)
高效液相色谱法测定制剂中维生素D3粉的含量
高效液相色谱法测定制剂中维生素D3粉的含量摘要用高效液相色谱法测定VD3粉中VD3的含量。
采用菲罗门氨基键合硅胶柱（250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-异丙醇（99：1）为流动相，流速为1.5ml/min，检测波长为265nm，柱温为25℃。
在此色谱条件下，维生素D3浓度在18.86μg/ml时进样量在10μl～100μl范围内呈良好的线性关系，r=1.0000，平均回收率为99.46%，RSD（n=6）为0.90%。
结论：本方法操作简便易行，系统使用性良好，适用于VD3粉中VD3的含量测定。
关键词：维生素D3粉；维生素D3；复方制剂；高效液相色谱法维生素D3（胆钙化醇；英文名：Vitamin D3）是一种脂溶性维生素，被看作是一种作用于钙、磷代谢的激素前体，帮助肠道内钙和磷的吸收，促进骨钙沉积，增加肾脏对钙、磷的重吸收，提高血钙、磷的浓度，有利于骨的矿化作用。
上市的补钙和补维生素的复方制剂中大多都含有VD3，由于VD3在复方制剂中含量极低，对光、热不稳定，在空气中易氧化和光解成前维生素D3、反式维生素D3、光甾醇和速甾醇等多种产物，在品种开发时多选取制成包合物的VD3粉为原料，以便提高产品的稳定性。
DSM生产的VD3粉加入维生素E、大豆油、明胶制成包合物的形式提高了稳定性。
但包合物的形式造成测定时VD3提取难度增大，有文献报到采用皂化后提取测定，此方法操作繁琐，而且提取中有损失影响结果。
另有采用稀释剂（DMSO-水10：2，0.2%BHT）溶解后，正己烷提取浓缩的方法，以达到液相测定浓度的要求，此方法操作时间长，提取浓缩过程中人为误差较大。
维生素D3粉进口注册标准JX2008006[7]中提取采用的是回流、萃取、旋蒸、充氮、溶解等方法，操作时间长、操作步骤繁琐，误差大。
本文参考相关文献[1] [2] [3] [8]并经验证，证明采用方法准确可靠，且操作简便、快速。
1仪器与试药高效液相色谱仪（赛默飞U3000、岛津SPD-M20A）；分析天平（奥豪斯AUW120D）；VD3对照品（批号：100061-201208，含量：99.8%，中国食品药品检定研究院）；VD3粉（10万单位/g，瑞士DSM Nutritional Products Ltd）；正己烷、异丙醇和甲醇为色谱纯；二甲基亚砜、二氯甲烷为分析纯。
饲料中维生素D3含量检测
饲料中维生素D3含量检测科标化工分析检测中心通过市场调查和实验结果，发现养殖户为了解决家禽缺乏维生素D3所带来的“弱腿病”、生长率和饲料利用率下降、产蛋率下降等问题，在饲料中添加维生素D3，为了更好的监测饲料中维生素D3含量，科标化工分析检测中心现开发了其检测方法。
科标化工分析检测中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、HB等标准完成食品、饲料、药品、纺织品、农业、高分子材料、生物产品、建筑材料以及微生物产品理化性能、力学性能、电气性能等测试。
中心通过了中国国家认证认可监督管理委员会和中国合格评定国家认可委员会的二合一（CMA、CNAS）实验室认证认可，能出具权威的第三方检测报告。
饲料中维生素D3的含量检测(高效液相色谱法)一、实验原理科标化工分析检测中心参照国标GB/T17818-2010饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法中第一法皂化提取法，试样经粉碎、过筛后，用碱溶液皂化，乙醚提取维生素D3，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇，取部分溶液用C18小柱净化，收集滤液，蒸发至干，用正己烷溶解，反相液相色谱柱分离测定，紫外检测器检测，外标法定量分析。
二、仪器和试剂试验地点：青岛科标化工分析检测中心实验室。
仪器：高效液相色谱仪带紫外检测器，AS3120超声波发生器；试剂：甲醇为色谱纯试剂，实验用水为超纯水，维生素D3标准品（购于日本CPE公司）。
三、试验方法1.皂化称取样品（配合饲料称取10g~20g，浓缩饲料10g，维生素预混饲料或复合预混合饲料1g~5g）精确至0.0001g，置于250ml圆底烧瓶中，加入50ml5g/LL-抗血酸乙醇溶液，混匀，加入10ml氢氧化钾溶液，混匀，置于沸水浴上回流30min，不时震荡防止样品粘附在壁上。
皂化结束，分别用5ml无水乙醇、5ml蒸馏水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至室温。
2.提取定量转移全部皂化液于盛有100ml无水乙醚的500ml分液漏斗中，用40ml水分3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，用160ml乙醚分三次萃取，合并乙醚相。
维生素D3的含量检验方法
维生素D3的含量检验方法一、目的：建立维生素D3含量检验操作规程，保证分析结果的准确性。
二、依据：GB/T 5413.9-1997含量检验操作三、范围：本规程适用于本公司维生素D3四、职责：质量检验员对本标准的实施负责五、正文：1、试制和溶液1.1 高峰氏淀粉酶（Taka-Diastase）1.2 异丙醇：色谱纯1.3 焦性没食子酸的乙醇溶液15g/L1.4 氢氧化钾溶液：质量比100:501.5 石油醚：沸程30~601.6 甲醇：重蒸后使用。
1.7 正己烷：色谱纯。
1.8 环己烷：色谱纯1.9 维生素D3标准储备液：含维生素D3100ug/ml（称取10mg维生素D3，用甲醇定容于100ml量瓶中）1.10 维生素D3标准工作液：取维生素D3标准储备液1ml于100ml量瓶中，用甲醇定容。
2、实验室常用仪器。
2.1 高效液相色谱仪：具有可变波长的紫外分光检测器、数据处理系统或记录仪。
2.2 平底烧瓶：250ml2.3 分液漏斗：500ml2.4 旋转蒸发器。
3 分析步骤3.1 试样处理准确称取10g样品，放入250ml平底烧瓶中，加入1gTaka淀粉酶（3.1），再加入30ml45~50℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞，置45℃烘箱内30min，于上述样品中加入100ml没食子酸的乙醇溶液（3.3），充分混匀后加入50ml氢氧化钾溶液（3.4），在蒸汽浴上回流30min后，立即冷却到室温。
将冷却后的皂化液转入500ml分液漏斗中，用100ml水分几次冲洗平底烧瓶，洗涤液并入分液漏斗中；于分液漏斗中加入100ml石油醚（3.5），盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min，静置分层，将水相放入另一500ml分液漏斗中。
重复上述萃取过程二次，合并醚液到第一个分液漏斗中。
用蒸馏水洗至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近干后，用石油醚转移至10ml量瓶中，定容。
高效液相色谱-质谱法检测血清中维生素D含量
关键词 ： 高效液相 色谱 一质谱 法； 维生素 Ｄ； 液质联 用； 固相萃取
中图分类号 ： Ｒ ９ ２ ７ ． ２ ； Ｒ９ ７ ７ ． ２ ４ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ６— ４ ９ ３ １ （ ２ ０ １ ３ ） ２ ０ —０ ０ １ ７— ０ ２
ＨＰＬＣ —Ｍ Ｃ ｆ ０ ｒ Ｄｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎｇ Ｖｉ ｔ ａ ｍｉ ｎ Ｄ Ｃｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ｎ Ｓ ｅ ｒ ｕｍ
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高效液相色谱法测定维生素预混合饲料中的25-羟基维生素D3
2020.11科学技术创新时间 /min 流速 /(mL/min) A /% B /% 0 0.8 15 85 10 1.0 0 100 15 1.0 0 100 16 0.8 15 85 200.8158525-羟基维生素D 3（25-OH-D 3），是维生素D 3在机体内的首个代谢产物，更易被吸收[1]。
目前，25-OH-D 3已广泛用于畜禽养殖业，用于提高蛋壳质量[2]、提高母猪怀孕率及窝产仔数[3-4]等。
目前关于饲料中25-OH-D 3含量测定的报道仅限于配合饲料及浓缩饲料[5-6],至于预混合饲料方面，仍为空白。
此外，维生素预混合饲料中25-OH-D 3的含量高，用量大，又是配合饲料和浓缩饲料中25-OH-D 3的来源。
因此，本文建立了维生素预混合饲料中25-OH-D 3含量测定的方法以期为维生素预混合饲料的质量控制提供技术手段。
1试验部分1.1仪器和试剂高效液相色谱仪（ACQUITY Arc ，Waters 公司）；电子天平（AB265-S ，梅特勒-托利多公司，精度为0.01mg ）。
25-OH-D 3标准品（Dr.Ehrenstorfer 公司，纯度为98.2%，批号为G155330）；甲醇为色谱纯；试验用水为一级水；维生素预混合饲料样品来自于市场收集。
1.2色谱条件采用Thermo AQUASIL-C 18色谱柱（规格为100mm ×3.0mm ，粒径3μm ），检测波长为264nm ；50μL 进样；柱温箱温度为30℃；流动相：A 相为水，B 相为甲醇，梯度洗脱程序见表1。
1.3试样溶液的制备称取维生素预混合饲料3g 置于50mL 棕色容量瓶中，加水10mL ，超声10min ，冷却；继续加入30mL 甲醇，混匀，超声提取20min ，冷却，用甲醇定容，稀释至刻度，摇匀；移取20mL 于离心管中，离心5min （6000转/min ）取上清，过0.22μm 滤膜，得到试样溶液。
液相色谱-串联质谱法检测饲料原料中维生素A、维生素D3、维生素E
分析与检测Oct 2018 CHINA FOOD SAFETY29现行的饲料中维生素A 、维生素D 3、维生素E（以下简称“VA、VD 3、VE”）的检测方法均为液相色谱法，其中VA 的检测方法为GB/T 17817-2010，定量限为1000IU/kg；VD 3检测方法为GB/T 17818-2010，定量限为500IU/kg；VE 的检测方法为GB/T 17812-2008，定量限为1IU/kg。
饲料原料中VA、VD 3、VE 含量在方法的定量限之下时，上述方法无法准确检出它们的含量。
虽然饲料原料中VA、VD 3、VE 的含量很低，但由于饲料原料的添加比例很大，因此饲料中VA、VD 3、VE 的总量十分很可观，故研究适用于饲料中VA、VD 3、VE 低含量的检测方法是一件十分有价值的工作。
1 研究内容1.1 优化前处理方法1.1.1 皂化反应溶液需先离心：皂化反应后的样液转移至离心管中，离心取上清液转移至分液漏斗中，防止样品残渣堵塞分液漏斗。
1.1.2 用石油醚代替乙醚：石油醚的提取效率和乙醚的提取效率基本相同，且因为石油醚的毒性低于乙醚，因此用石油醚代替乙醚。
1.2 考查线性相关性用甲醇溶液配置VA、VD 3、VE 工作液，其系列浓度分别为0.1IU/L、0.5IU/L、1.0IU/L、5.0IU/L、20.0IU/L、100IU/L。
相同条件下，用串联质谱检测上述曲线各点的峰面积，VA 的浓度与峰面积的相关系数为0.9998，VD 3的浓度与峰面积的相关系数为0.9999，VE 的浓度与峰面积的相关系数为0.9995。
1.3 净化小柱的选择根据VA、VD 3、VE 的性质特点，应选取吸附特性为非极性的净化小柱。
经查阅资料，选择安捷伦公司提供的Bond Elut ENN、Bond Elut LMS、Bond Elut ENV、Bond Elut PLEXA4种净化小柱。
笔者分别考察并进行了VA、VD 3、VE 过净化小柱的回收率，其中，Bond Elut PLEXA 净化小柱VA、VD 3过柱回收率达到99%，VE 过柱回收率达到93%。
高效液相色谱法测定保健品中维生素D 含量
高效液相色谱法测定保健品中维生素 D 含量
□ 罗 骁 吴帅龙 李彩玲 广电计量检测（合肥）有限公司
摘 要：建立了一种使用液相色谱 - 紫外检测器，以维生素 D2、D3 互为内标，测定保健食品中维生素 D 的方法。样 品经淀粉酶水解，无水乙醇 - 氢氧化钾皂化，皂化液用石油醚萃取、水洗、干燥，旋转蒸发至约 2 mL，氮吹至干，甲醇溶 解定容，内标法定量。维生素 D2 和维生素 D3 的分离度为 1.5，线性范围为 0.01 ～ 5.0 μg/mL，相关系数 R2 ≥ 0.999； 相对标准偏差 RSD（n=6）为 2.82% ～ 5.10%；加标回收率 96.23% ～ 104.26%。当取样量为 5.000 g 时，VD2、VD3 的 检出限均低于 0.2 μg/100 g。
关键词：维生素 D；保健食品；液相色谱（HPLC）；内标法
维 生 素 D3 与 维 生 素 D2 为 脂 溶 性 维生素，主要功用是调节细胞生长分 化和人体免疫功能，有利于新骨生成 和钙化，促进骨骼生长 [1]，预防骨质 疏松症。但维生素 D 摄入过多，可引 起高血钙、甚至软组织异位骨化等 [2]。
Toledo），高效液相色谱仪（LC-20A， 5009.82-2016）第四法，准确称量某
维生素 D2 D3
线性范围 μg/mL 0.01 ～ 5.0 0.01 ～ 5.0
表 1 线性方程、相关系数（r2）及定量下限
线性方程
相关系数，r2
检出限 μg/100 g
C=1.0575A-0.0552
0.9999
0.1954
C=1.3888A-0.4966
0.9996
0.1723
Hale Waihona Puke 定量限 μg/100 g 0.6513 0.5743
添加剂预混合饲料维生素D3微粒的检验操作规程
称取样品适量（称准至0.0001g），置250ml皂化瓶中，加50－60ml抗坏血酸乙醇溶液，使试样完全分散、浸湿，加10ml氢氧化钾溶液混合均匀，置于沸水浴上煮沸回流30min，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5ml乙醇、5ml水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出，冷却至约40℃。
从乙醚提取液中分取一定体积（依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量），置于旋转蒸发器烧瓶中，在部分真空，水浴温度50℃的条件下蒸发至干，或用氮气吹干。残渣用正已烷溶解，并稀释至每1ml含维生素D32～10μg（80～400IU），离心或通过0.45μm过滤膜过滤，用于高效液相色谱分析柱分析。
高效液相色谱分析条件（正相）：
定量转移全部皂化液于盛有100ml乙醚的500ml分液漏斗中（分液漏斗活塞涂以甘油淀粉润滑剂），用30～50蒸馏水分2～3次冲洗皂化瓶并入分液漏斗，加盖，放气，随后混合，激励振荡2min,静置分层。转移水相于第二个分液漏斗中，分次用100ml，60ml乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用氯化钠溶液100ml洗涤一次，再用蒸馏水每次100ml洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠脱水，转移到250 ml棕色量瓶中，加100mgBHT使之溶解，用乙醚定容至刻度，摇匀。以上操作均应在避光通风柜中进行。
氮气99.9％；
维生素D3标准溶液：
维生素D3标准贮备液：准确称取50.0mg维生素D3（胆钙化醇）USP结晶纯品，于50ml棕色容量瓶中，用正已烷溶解并稀释至刻度，4℃保存。该贮备液的浓度为每ml含1mg（40000IU）维生素D3。
维生素D3标准工作液：准确吸取上述维生素D3标准贮备液，用正已烷按1:100比例稀释，该标准溶液的浓度为每ml含10μg（400IU）维生素D3。
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Hs
Cs
d
2 f
Ds
u
Cs：常数（与k有关），Ds为扩散系数，df 固定液厚度
固定相引起峰扩展解决办法： 液液分配色谱：
使用薄的固定相 吸附、排阻和离子交换色谱：
使用小颗粒填料。
2020/3/12Leabharlann 滁州学院材料与化学工程学院
6
（2）流动相传质阻力项
① 流动相中传质阻力相Hm
Hm
Cm
d
2 p
固定液为极性，流动相为非极性
反相色谱：
固定液为非极性，流动相为极性。
➢ 由于液—液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。
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化学键合相色谱(CBPC) 通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，
代替机械涂渍的液体固定相。 这种固定相避免了固定相流失，大大改善了固定相功能， 适用于梯度洗脱，分离选择性大大增加。
X 水相
Dm
u
Cm：常数（与k有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构 ） Dm：流动相中扩散系数，dp ：为填充物的平均直径
② 滞留的流动相中传质阻力相Hsm
多孔固定相造成的部分流动相滞留。
H sm
Csmd
2 p
Dm
u
H = He + Hd+Hs+Hm+Hms
Hd可以忽略
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• HPLC和GC的H-u图十分相似，区别是： • HPLC板高H比GC小一个数量级，说明HPLC柱效高 • 对于HPLC，为了取得良好的柱效，流速不一定要很高。
降低H，提高柱效的方法
减小填料粒度 减小填料孔穴深度 用低粘度溶剂作流动相 采用低速流动相 （通常： u=1mL/min）
第3章 高效液相色谱法
（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）
教学要求
了解高效液相色谱仪的一般构造流程及部件 熟悉高效液相色谱法色谱条件的选择 掌握液相色谱的各种分离机理及适用对象 掌握各种检测器的原理及特性 掌握常用液相色谱固定相及流动相的特性及选用原则
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3、离子对色谱法（Ion Pair Chromatography, IPC） 分离强极性的有机酸、碱存在的问题： 用正相色谱：保留值太大、峰拖尾，甚至不出峰。 用反相色谱：保留太小。 采用离子对色谱可以解决以上问题：
将与溶质离子电荷相反的离子加到流动相或固定相中， 与溶质离子形成离子对，从而控制溶质离子保留行为。
如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。
因此，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。
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§2-1 高效液相色谱法的特点
特点：
高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa 高速：分析速度快； 高效：柱效很高。（n>30000）
B/u小，u无需高
H小，柱效高
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§2-3高效液相色谱法主要类型及分离原理
根据固定相和分离机理的不同，液相色谱法可分为： 1、液液分配色谱法（LLC） 2、液固吸附色谱法（LSC） 3、离子对色谱法（IPC） 4、离子交换色谱法（IEC） 5、离子色谱法（IC） 6、空间排阻色谱法（SEC）
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1、液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—液分配色谱： 基于组分在两相间多次分配产生差速迁移实现分离。
固定相：载体+固定液 载体：硅胶；
为了避免固定相流失，固定相和流动相极性要相差大
（与GC不同, GC:极性相似相溶 ）
正相色谱：
应用最普及
H2O、甲醇等使用方 便；价格便宜
可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：10-9g （UV）；10-11g （荧光检测）
局限性： 设备昂贵 维持费较高（柱填料和流动相价格高 ）
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HPLC与GC的比较 分析对象及范围： GC：气体和低沸点的稳定化合物。（~20%） HPLC：高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（~80%） 流动相的选择： GC：有限的几种气体，只运载作用，对组分作用小； HPLC：液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。
化学键合相色谱的出现，是HPLC的重大突破 化学键合色谱是HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固
定相的四分之三。 它适用于分离几乎所有类型的化合物 。
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2、液－固吸附色谱（adsorption chromatography）： 基于组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而分离。 组分分子结构与吸附剂几何结构相适应时，易于吸附 应用： 分离几何异构体 分离不同的官能团的化合物。 但不能用于分离同系物。
流动相除了起运载作用外，还可与组分作用。 操作温度： GC：需较高温度； HPLC：室温下进行。
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§3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
1、涡流扩散项 He
H = A + B / u + C·u
He = 2λdp
He Hd
同GC：λ:填充不规则因子，dp :填充物平均直径。
学时：4学时
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液相色谱是以液体为流动相的色谱方法。 现代液相色谱采用高压输液系统输送流动相，且分析速度
快、分离效率高。
故称高效液相色谱法（HPLC）；又称高压或现代液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography） HPLC则适合于分析用气相色谱难以分析的物质。
2、纵向扩散项 Hd
Hd=CdDm/u
Cd为常数，Dm为扩散系数，u为流动相线速度。
液体扩散系数Dm比气体Dg小得多（小10-4~10-5）
∴ HPLC中：Hd的影响通常可以忽略 而GC中，纵向扩散项很重要
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3、传质阻力项
（1）固定相传质阻力项