临床检验主管技师 微生物检验 第八章 培养基
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一. 基础知识（一）微生物基础知识1.培养基培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。
另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。
加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。
但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。
一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
（二）消毒与灭菌知识5.2灭菌方法灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。
本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。
通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。
蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
（三）洁净室行为规范（四）实验室安全知识二. 基本操作（一）培养基配制、灭菌、使用和保藏1.配制1.1 按照培养基瓶签所示，准确称量一定培养基干粉于合适的容器，加纯化水溶解。
1.2 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。
1.3 如需分装，应先加热搅拌，待培养基完全溶解并均一后进行。
分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免污染。
液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
1.4 培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
《微生物培养基》课件
在医学中的应用
疾病诊断
培养基用于临床标本的分离、鉴定，协助医生诊断疾病。
抗生素敏感性试验
培养基用于抗生素敏感性试验，指导临床合理用药，提高治疗效果。
04
CATALOGUE
微生物培养基的发展趋势
新型微生物培养基的开发
新型微生物培养基的开发是当前 研究的热点之一，旨在寻找更高 效、更环保、更经济的培养基配
THANKS
感谢观看
培养基的特性
培养基必须含有微生物生长繁殖所需的基本营养成分，包括 水、碳源、氮源、无机盐等，同时还要满足微生物对pH、渗 透压等环境条件的要求。
微生物培养基的种类
固体培养基
在液体培养基中加入凝固剂（如 琼脂）制成，呈固态，多用于菌
种分离、鉴定和菌落计数等。
液体培养基
不含凝固剂的培养基，呈液态，适 用于工业生产中大规模培养微生物 。
微生物培养基的优化研究主要涉及单因素实验、正交实验和响应面法等方法，通过 这些方法可以找到最优的培养基配方。
微生物培养基的未来展望
随着合成生物学和代谢工程的发展， 未来的微生物培养基将更加智能化和 个性化。
未来的微生物培养基将更加注重环保 和可持续发展，减少对环境的污染和 资源消耗，同时提高培养基的经济效 益和社会效益。
水
是微生物生长所需要的基本营养 成分之一，是构成细胞的重要成 分，也是培养基中其他营养成分 的溶剂。
生长因子
是一些维生素、氨基酸等有机物 ，对某些微生物的生长繁殖是必 需的。
02
CATALOGUE
微生物培养基的制备
制备前的准备
了解培养目的
明确微生物培养的目标，是为了纯培 养、鉴别、生理研究还是大规模生产 。
方。
临床微生物检验考试复习重点知识总结
绪论，1.细菌的发现者：安东尼·范·列文虎克，1665年，列文虎克研制出了第一台显微镜，1675年，通过显微镜看到了细菌。
法国的化学家、微生物学家巴斯德：“曲颈瓶实验”建立了病菌学说；创立了巴氏消毒法；研制了鸡霍乱杆菌、炭疽杆菌减毒菌苗、狂犬疫苗。
德国的细菌学家郭霍：发明了固体培养基，并创立了细菌染色法；创立了实验动物感染方法。
英国细菌学家亚历山大·弗莱明发现了青霉素2.微生物：是存在于自然界的一大群形体微小、结构简肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜和电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的微小生物。
按照微生物的大小、结构和组成分类：原核细胞型微生物（细胞核无核膜、核仁，呈环状裸DNA结构，包括细菌、放线菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体）真核细胞型微生物（细胞核分化程度高，有核膜、核仁，细胞器完整，包括真菌和原虫）非细胞型微生物（仅有一种核酸类型，包括病毒、亚病毒、朊粒）根据微生物与人类的关系分类：正常菌群：定居在人类皮肤和黏膜上的各类微生物，在正常情况下无害，而且具有拮抗外来病原微生物和提供某些营养物的作用。
条件致病微生物：原属正常菌群中的细菌，由于机体抵抗力下降、寄居部位改变或寄居微生物丛平衡失调，能引起内源性感染。
病原微生物：指少数能引起人类和动、植物致病的微生物。
3.微生物学：是生物学的一个分支，它是研究微生物的类型、分布、形态结构、生命活动及规律、遗传、进化以及与人类、动物、植物等相互关系的一门学科。
随着其研究的深入，形成了很多分支学科。
4.医学微生物学：是研究与医学和疾病有关的病原微生物的生物学特性、致病性、免疫性以及特异性诊断和预防治疗措施的学科。
5.临床微生物学的性质和任务：1.研究感染性疾病的病原体特征2.提供快速而准确的病原学诊断3.指导临床合理使用抗菌药物4.对医院感染进行监控6.临床微生物检验的思路与原则：1.确保分析前质量2.全面了解机体的正常菌群3.保证检验过程中的质量4.采用三定一结合（定性、定量和定位，结合病情）5.重视和加强与临床的联系第一章1.生物安全：采用微生物学技术、安全设施、保护设备,防止实验室工作人员、环境及公众暴露于实验室中处理储存的已知或潜在的感染性微生物。
初级检验技师《微生物检验》讲义第8章培养基讲课稿
培养基培养基是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。
适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、生化特性，是病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。
一、培养基的组成成分（一）营养物质细菌需要的基础营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等，常用的营养物质如下：1.蛋白胨蛋白胨是制备培养基时最常用的成分之一，提供细菌生长繁殖所需要的氮源。
2.肉浸液是用新鲜牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。
其中含有可溶性含氮浸出物（肌酸、黄嘌呤、腺嘌呤、谷氨酸、甘氨酸等）和非含氮浸出物（肝糖、乳酸、琥珀酸、磷酸己糖、脂肪、无机盐等）。
还有一些生长因子。
肉浸液可为细菌提供氮源和碳源，但肉浸液中所含氮物质过少而不能满足细菌的需要，因此在制备培养基时应再加入1%～2%的蛋白胨和0.5%NaCl。
3.糖类、醇类为细菌生长提供碳源和能源。
制备培养基所用的糖类、醇类有多种，常用的糖类有单糖（葡萄糖、阿拉伯糖等）、双糖（乳糖、蔗糖等）和多糖（淀粉、菊糖等）；常用的醇类有甘露醇、卫茅醇等。
除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。
4.无机盐类提供细菌生长的各种元素，如：钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。
用于制备培养基的无机盐类有多种，其中最常用的有氯化钠和磷酸盐，前者对维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压非常重要，后者是细菌良好的磷源，并在培养基中具有缓冲作用。
5.生长因子是细菌生长所必需的，但需要量很小。
在制备培养基时，常加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。
血液中可提供辅酶（如V因子）、血红素（X因子）等特殊生长因子，所以，在培养基中加入血液可用于培养营养要求较高的细菌。
（二）凝固物质最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。
琼脂是从石花菜中提取出来的一种多糖，在45℃以下则凝固成凝胶状态，是一种理想的固体培养基赋形剂。
微生物检验培养基配制作业指导书
文件制修订记录1.0目的规定了培养基配制的基本要求及方法。
2.0范围适用于大肠菌群、细菌总数、霉菌及酵母菌检测时用培养基配制。
3.0术语无4.0职责微生物检验员负责对培养基的正确配制。
5.0工作流程图无6.0内容及要求6.1乳糖胆盐发酵培养基6.1.1 用途：用于测定大肠菌群的乳糖发酵实验；6.1.2 成分（g/l）：蛋白胨（20g）、乳糖（10g）、猪胆盐（5g）、溴甲酚紫（0.01g）；6.1.3 配制方法：称取乳糖胆盐发酵培养基35g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装于有倒立发酵管的试管中，115℃高压灭菌15min，备用；6.1.4 注意事项：灭菌后应在无菌环境下操作，出现结块严禁继续使用。
6.1.5储存条件：常温、密封、干燥处。
6.2 平板计数琼脂6.2.1 用途：用于细菌总数测定；6.2.2 成分（g/l）：胰蛋白胨（5g）、酵母浸粉（2.5g）、葡萄糖（1g）、琼脂（15g）；6.2.3 配制方法:称取本品23.5g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15min后备用；6.2.4 注意事项：灭菌后应在无菌环境下操作，出现结块严禁继续使用。
6.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.3.1 用途：用于大肠菌群、大肠杆菌、粪大肠菌群的初发酵试验及大肠杆菌（MPN）计数；6.3.2 成分（g/l）：胰蛋白胨（20g）、月桂基硫酸钠(0.1g)、乳糖（5g）、硫酸氢二钾（2.75g）、氯化钠（5g）、磷酸二氢钾（2.75g）；6.3.3 配制方法:称取本品35.6g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装到有玻璃小导管的试管中，每管10ml，121℃高压灭菌15min后备用；6.3.4 注意事项：灭菌后应在无菌环境下操作，出现结块严禁继续使用。
6.3.5储存条件：常温、密封、干燥处。
6.4煌绿乳糖胆盐肉汤6.4.1用途：用于大肠菌群复发酵试验，（MPN）计数及证实试验。
微生物实验培养基配方
微生物学实验常用培养基的配制1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）121℃灭菌20min。
2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000mL。
121℃灭菌20min。
3、查氏（Czapek）培养基（培养霉菌用）121℃灭菌20min。
4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）112℃灭菌30min。
临用前加入0.03%链霉素稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
5、马铃薯培养基（简称PDA）（培养真菌用）培养基的配制：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至1000mL。
121℃灭菌30min。
6、麦芽汁琼脂培养基培养基的配制：(1)、取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
(2)、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。
加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
(3)、将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
(4)、将滤液稀释到5—6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂即成。
121℃灭菌30min。
7、无氮培养基（自生固氮菌、钾细菌）113℃灭菌30min。
8、半固体肉膏蛋白胨培养基121℃灭菌20min。
9、合成培养基加12 mL0.04%的溴钾酚紫（pH5.2—6.8，颜色由黄变紫，作指示剂）。
121℃灭菌20min。
10、豆芽汁蔗糖（或葡萄糖）培养基培养基的配制：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加入水1000mL，煮沸约30min，用纱布过滤。
微生物限度检查培养基及稀释液配制记录
微生物限度检查培养基及稀释液配制记录培养基配制记录：1.培养基名称：牛肉膏蛋白胨培养基配制日期：XXXX年XX月XX日配制人员：XXX配制方法：a. 准备所需原料：牛肉膏10g，蛋白胨10g，葡萄糖5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
b. 将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠加入1000ml三角瓶中，加入适量蒸馏水悬浮均匀。
c.加入琼脂并混合均匀。
d.用石膏或毛玻璃棒将溶液均匀搅拌，在蒸发皿上蒸汽加热至显出小气泡，即可。
e.将培养基分装至培养基瓶中，密封保存于4℃。
2.培养基名称：营养琼脂培养基配制日期：XXXX年XX月XX日配制人员：XXX配制方法：a. 准备所需原料：肉浸膏10g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
b. 将肉浸膏、葡萄糖加入1000ml三角瓶中，加入适量蒸馏水悬浮均匀。
c.加入琼脂并混合均匀。
d.用石膏或毛玻璃棒将溶液均匀搅拌，在蒸发皿上蒸汽加热至显出小气泡，即可。
e.将培养基分装至培养基瓶中，密封保存于4℃。
稀释液配制记录：1.稀释液名称：理化盐水稀释液配制日期：XXXX年XX月XX日配制人员：XXX配制方法：a.准备所需原料：氯化钠8.5gb. 将氯化钠加入1000ml蒸馏水中，充分溶解，即可。
c.将稀释液分装至滴定瓶中，密封保存于室温。
2.稀释液名称：0.9%盐水稀释液配制日期：XXXX年XX月XX日配制人员：XXX配制方法：a.准备所需原料：氯化钠9gb. 将氯化钠加入1000ml蒸馏水中，充分溶解，即可。
c.将稀释液分装至滴定瓶中，密封保存于室温。
以上是微生物限度检查培养基及稀释液配制的记录示例，实际操作中需根据具体的实验要求和配方进行调整。
在配制过程中，应按照相应的配方和方法进行操作，确保培养基和稀释液的质量和洁净度。
完成后，应将培养基和稀释液分装保存，并严格控制储存温度，以确保后续实验的准确性和可重复性。
微生物检验培养基质量控制技术
计数培养基适用性检查
结果判定
被检培养基上的菌落平均数 对照培养基上的菌落平均数
≥ 70%
菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致
计数培养基
控制菌检查用培养基适用性检查
检查项目
促生长能力 抑制能力 指示能力
控制菌检查用培养基适用性检查
增菌培养基促生长能力检查：分别接 种不大于100cfu 的试验菌于被检培养 基和对照培养基中，在相应控制菌检 查规定的培养温度及最短培养时间下 培养。与对照培养基管比较，被检培 养基管试验菌应生长良好。
控制菌检查用培养基的适用性检查： CHP与USP方法基本一致，检查用培养基不同。
同行的方法介绍
培养基质量控制
➢ 理化试验方法 包括测定培养基的pH值和凝胶强度 ➢ 微生物学方法 包括固体培养基和液体培养基
同行的方法介绍
固体培养基
➢ 定量质控 采用倾注平板法、涂布法、 划线法(半定量法) 、改良的Miles－Misra 法等测定生长情况；
新技术介绍
BioBall
目前可以提供超过25种菌株； 可应用于培养基质控、方法验证
等 需要定量质控的各个领域；
新技术介绍
BioBall SingБайду номын сангаасeShot 量
提供1次精确接种
BioBall MultiShot-550 提供10次精确接 种量
新技术介绍
BioBall SingleShot
每个BioBall SingleShot都含28至 33cfu；
培养基适用性检查
计数培养基
控制菌检查用 培养基
计数培养基适用性检查
对照培养基 系指按培养基处方特别 制备、质量优良的培养基，用于培养 基适用性检查。由中国药品生物制品 检定所研制及分发。
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第八章培养基
本章内容
一、培养基的组成成分
二、培养基种类
三、分离培养基的选择
培养基
人工配制专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。
组成成分：
1.营养物质
2.凝固物质
3.抑制剂或指示剂
培养基的组成成分
营养物质：应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等。
（1）蛋白胨提供氮源。
（2）肉浸液可提供氮源和碳源。
（3）牛肉膏营养价值低于肉浸液，但因无糖可用作肠道杆菌鉴别培养基的基础成分。
（4）糖类除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外，其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。
（5）血液既含有营养物质，又能提供生长因子，所以用于培养营养要求较高的细菌。
另外，还可根据细菌在血液培养基中的溶血现象而进行鉴定。
（6）无机盐类提供各种元素，如：钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。
（7）鸡蛋和动物血清仅用于制备一些特殊的培养基。
如培养结核分枝杆菌的鸡蛋培养基和培养白喉杆菌的吕氏血清培养基等。
（8）生长因子常在培养基中加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。
凝固物质
最常用的凝固物质为琼脂，特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。
抑制剂和指示剂：用于选择、鉴定及判断结果。
1.抑制剂：必须具有选择抑制作用。
目的在于抑制非检出菌（非目的菌）的生长，以利于检出菌（目的菌）的生长。
常用胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。
2.指示剂：在培养基中加入一定种类的指示剂，是为了观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。
常用的有酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国蓝等酸碱指示剂。
亚甲蓝常用作氧化还原指示剂。
培养基种类
1.基础培养基：肉汤。
含牛肉浸液和蛋白胨。
广泛用于细菌的增菌、检验，也是制备其他培养基的基础成分。
2.营养培养基：基础培养基中加入特殊成分，供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长。
如血琼脂平板、巧克力血平板。
3.鉴别培养基：观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物通过指示剂显示来鉴别细菌。
如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-亚甲蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。
4.选择培养基：加入抑制剂抑制标本中杂菌生长，有助于所选择的细菌种类生长（SS琼脂）。
5.特殊培养基：厌氧培养基和细菌L型培养基（疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基、高渗培养基）等。
分离培养基的选择
根据标本来源、培养目的、可能存在的病原菌。
1.营养肉汤：标本及各类细菌的增菌培养。
2.血平板：各类细菌检验标本的分离。
3.巧克力血平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
4.中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板：筛选革兰阴性细菌；鉴别发酵型革兰阴性杆菌菌种。
5.麦康凯平板：筛选革兰阴性杆菌和非发酵菌。
6.SS琼脂：筛选肠道致病菌，如志贺菌和沙门菌。
7.碱性琼脂或TCBS琼脂：从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。
8.血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。
血琼脂平板是
A.选择培养基
B.基础培养基
C.营养培养基
D.特殊培养基
E.鉴定培养基
『正确答案』C
『答案解析』血琼脂平板是营养培养基，是在基础培养基的基础上加入了血液。
在培养基中加入某种化学成分或抗生素以抑制某些细菌的生长而有助于需要的细菌生长，此培养基称为
A.基础培养基
B.鉴别培养基
C.选择培养基
D.营养培养基
E.特殊培养基
『正确答案』C
『答案解析』选择培养基：加入抑制剂，抑制标本中杂菌生长，有助所选择的细菌种类生长（SS琼脂）。
下列哪种为鉴别培养基
A.血平板
B.普通营养琼脂
C.克氏双糖铁琼脂（KIA）
D.SS琼脂
E.巧克力平板
『正确答案』C
『答案解析』克氏双糖铁琼脂（KIA）为鉴别培养基，其加入的是指示剂。
用于培养肠道致病菌的强选择性培养基是
A.SS平板
B.中国蓝平板
C.双糖铁培养基
D.乳糖发酵管
E.巧克力平板
『正确答案』A
『答案解析』SS平板是用于培养肠道致病菌的强选择性培养基。
用于志贺菌及沙门菌分离的培养基是
A.血平板
B.麦康凯平板
C.营养肉汤
D.SS琼脂
E.TCBS琼脂
『正确答案』D
『答案解析』SS琼脂：筛选肠道致病菌如志贺菌和沙门菌。
分离培养流感嗜血杆菌的常用培养基为
A.血平板
B.巧克力培养基
C.SS培养基
D.TCBS培养基
E.EMB培养基
『正确答案』B
『答案解析』巧克力血平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。
患者女，哺乳期，右侧乳房出现红肿痛，并形成脓肿，无菌抽取脓液做细菌培养时，首选的分离培养基是
A.肉汤培养基
B.营养琼脂
C.血平板
D.巧克力平板
E.麦康凯培养基
『正确答案』C
『答案解析』患者可能为金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎，因此应选用血平板进行分离培养。
观察细菌动力最常使用
A.液体培养基
B.半固体培养基
C.固体平板培养基
D.固体斜面培养基
E.厌氧培养基
『正确答案』B
『答案解析』半固体培养基最适用于观察细菌动力。
在肠杆菌科的细菌鉴定中，选择性培养基的选择主要取决于
A.标本类型
B.取材的时间
C.标本量的多少
D.患者年龄
E.临床症状
『正确答案』A
『答案解析』在肠杆菌科的细菌鉴定中，选择性培养基的选择主要取决于标本类型。
KIA琼脂一般不用于观察
A.乳糖发酵
B.葡萄糖发酵
C.硫化氢产生
D.产气现象
E.动力
『正确答案』E
『答案解析』KIA琼脂常用于观察微生物发酵葡萄糖和乳糖的能力，而不用于观察动力。