关于基因变异的研究方法及其进展

关于基因变异的研究方法及其进展

摘要：高通量、高分辨率基因组学技术的出现推动了人类基因组中长度在

1Kb~3Mb的亚显微水平结构变异检测方法的发展，这些结构变异主要包括基因拷贝数变异、倒置、插入、缺失、重复及其它基因重排，而传统的细胞遗传学技术达不到如此高的分辨率，该文先主要介绍基因变异的具体概念及几种分类标准，然后就本人所了解详细介绍突变分析技术及其具体原理，如限制性片段长度多态性（RFLP）、寡核苷酸杂交、荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、异源双链体形成分析（HA）、高分辨率熔解曲线（HRM）、变性高效液相色谱分析（DHPLC）、体外蛋白截短实验（PTT）、定量多重PCR技术（QM-PCR）和DNA序列分析（DNA sequencing）等十大分析技术。并且，进一步以实例来介绍下这些技术在临床上的运用。最后，简单分析各个技术的优缺点，讨论下自己对于突变研究方法的一点简单想法和展望。

关键词：基因变异检测技术临床疾病

人类遗传变异被Science杂志评为2007年世界十大科技突破之一。近年来的研究表明人类基因组存在大量变异，研究这些变异不仅有助于揭示许多复杂疾病和个体性状的遗传学机制，也加快了个性化用药的步伐，而关于基因变异的研究方法则印证了“工欲善其事，必先利其器”这一原理，根据不同变异类型，可以找到相对应的技术。这面就基因变异和技术做一具体综述。

基因变异

根据发生突变的碱基数目，遗传变异可分为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）和结构变异（structural variations,SVs）。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化，而且其中至少一种等位基因在群体中的频率不小于1%，它是继限制性片段长度多态性（restriction fragment length poltmorphism,RFLP）和微卫星多态性（microsatellite polymorphism）这两种遗传标记之后，成为第三代分子标记。而结构变异则指1Kb以上的DNA碱基的改变，进一步分为大于3Mb的显微水平结构变异和大小在1Kb~3Mb之间的亚显微水平结构变异。

从另一个角度，我们知道广义突变包括染色体畸变，狭义突变专指基因DNA 水平的改变，而本文关于基因变异的综述主要是从突变的狭义角度出发。理论上导致基因突变的原因可以分成两类，一类是诱导性（induced）突变，包括物理因素，X-ray或其他高能射线；化学因素，如碱基相似物、烷化剂的使用等；生物因素，如病毒基因的插入等。另一类是指自发性（spontaneous）突变，DNA 复制过程中的配对错误。如DNA氧化损伤是细胞自发突变的主要原因之一，在各种DNA氧化损伤产物中，8-羟基鸟嘌呤（8-OhdG）性质稳定，常作为生物标志应用于细胞DNA氧化损伤程度的评估，并且作用机理主要是由于8-OhdG倾向与腺嘌呤（A）配对，导致G>T突变。

根据基因突变的形式，又可以将突变类型分为点突变（point mutation）、框内突变(inframe mutation)和DNA大片段缺失或复制(large deletion or duplication)。

一、点突变，指只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。

1、根据碱基替换可分为同义突变（samesense mutation）、错义突变（missense mutation）和无义突变（nonsense mutation）。其中同义突变是指碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码的氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止

突变；错义突变指碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸；无义突变是指碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子，其将会产生截短型蛋白。

2、根据碱基的插入和缺失，点突变又有移码突变，即基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称为移码突变（frameshift mutation），并可在突变点下游提前出现终止密码而产生截短型蛋白。

二、框内突变，指三个或是三的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加一个或几个氨基酸。

三、DNA大片段缺失或复制，指几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。其中可能出现基因扩增现象，即基因片段数十倍至数百倍的增加，从细胞遗传性现象，可观察到双微体和染色体均染区的出现。

突变分析技术概况、原理及应用

一、以限制性片段长度多态性为原理而建立的限制性酶切分析技术，该技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。

每个个体在遗传上是不同的，而不同的本质是在DNA水平上的差异，即DNA 多态性，它是由于进化过程中各种原因而引起的染色体DNA中核苷酸排列顺序发生改变，当这种改变涉及限制性内切酶识别位点时，利用限制性内切酶可将DNA切割成不同长度的限制性片段，这类不同长度的限制性片段类型在人群中所呈现的多态频率分布现象就称为限制性片段长度多态性。并且RFLP可分为单碱基突变型和结构重排型两大类，单碱基突变型是由于限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换，使这一限制性位点发生丢失或获得因而产生的多态性，也称为点多态性。结构重排型是由于DNA顺序内部发生较大的顺序变化，这种类型也包括两类，一类是由于DNA顺序上发生突变引起的，如缺失、重复和插入等。另一类是由于不同个体高变区所串联的重复顺序拷贝数相差悬殊，因此高变区的长度变化很大，从而使高变区两侧限制性内切酶识别位点的固定位置随着高变区的大小而发生相对位移。

根据RFLP理论，结合PCR技术，即可以运用限制性片段长度多态性PCR技术去分析基因突变，它的理论依据是首先利用PCR扩增目的基因，然后用限制性内切酶酶解样品DNA，产生大量的限制性酶切片段。将限制性酶切产物进行含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下即可分辨各种限制性片段的大小及其位置。或者将限制性酶切产物与探针杂交进行放射自显影，从而区分各种片段。由于目标DNA之间存在有同源性和变异性，当用同一种限制性内切酶酶解不同品总或同一品种的不同个体时，不同酶切产物中就会含有相同或不同的长度片段，从而解读出目标样品之间在DNA分子水平的实际差异。

如建立聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测HBV核心启动子（BCP）基因突变的方法，PCR扩增HBV BCP区基因片段，经限制性内切酶MboⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分析BCP基因突变情况，经酶切后可以产生两种结果，①HBV BCP区存在突变时，产生MboⅠ酶切位点，出现123bp和262bp两条带；②HBV BCP区不存在突变时，由于无MboⅠ酶切位点，电泳后只出现385bp 一条带。

二、建立在Southern blot、寡核苷酸杂交及芯片原理上的杂交分析技术。

运用杂交原理研究基因变异主要和Southern blot 、寡核苷酸杂交及芯片技术有关。如果一个基因的突变部位经测序分析已经阐明，即可用PCR-寡核苷酸探