siRNA反向转染人肺动脉平滑肌细胞的条件优化
RFect siRNA淋巴细胞转染
RFect siRNA淋巴细胞转染产品描述RFect siRNA转染试剂是专为将RNAi双链(siRNA)转染真核细胞而设计的新一代动物源性游离脂质转染试剂。
RFect由不同的脂质组成，在大多数细胞系中表现优异，但也存在一定的差异。
无论血清存在与否，SiRNA-RFect复合物可直接添加到培养基中的细胞中。
转染后无需去除复合物或改变/添加培养基，但复合物可在4-6小时后去除。
RFect siRNA转染试剂的优点转染效率高90%或更多的速度和明显的基因击倒效果(如。
在A549细胞中，Lamin A/C基因敲除效率达95%以上)。
最小的细胞毒性(少于10%的细胞转染后死亡率),以减少非特异性作用和细胞压力。
需要低浓度的siRNA获得高水平的可拆卸的。
广泛的转染细胞:我们可以获得理想的大多数附着细胞系转染结果。
储存、稳定、特殊处理RFect核转染试剂在室温下稳定运输和长期储存(12个月)在4°C。
RFect siRNA转染试剂仅供研究使用。
转染的重要指南转染过程中不要向培养基中添加抗生素，因为这可能导致细胞死亡。
以10nm siRNA为起始点，虽然siRNA浓度可以远低于10nm。
正向转染和反向转染协议可用于大多数细胞株。
协议:向前转染使用以下步骤将siRNA以24孔的形式转染到细胞中。
有关其他格式，请参见放大或缩小转染。
优化转染如优化转染中所述，特别是在首次转染细胞株时。
所有数量和体积均按每口井计算。
答:板细胞在转染前的一天,500μl板细胞生长介质没有抗生素,这样细胞将30 - 50%时汇合的转染。
B.准备siRNA-RFect复合物1. 稀释6 pmol siRNA 50μl没有血清的培养基。
2. 稀释2μl RFect 50μl没有血清的培养基。
轻轻搅拌，室温下孵育5分钟。
注意:在25分钟内进行第3步。
3.5分钟后孵化,结合稀释的稀释siRNA RFect(总量= 100μl)。
轻轻搅拌，室温下孵育20分钟。
siRNA靶向沉默TrkB基因对人膀胱癌细胞株T24生长和转移的影响及其分子机制
［摘 要］ 目的 研究 ｓｉＲＮＡ靶 向沉 默酪氨酸激酶受休 （Ｔｒｋ）Ｂ基 因对人膀 胱癌细胞 株 ３＂２４生长和转 移的影 响及其分 子机 制 。方 法 用 ｓｉＲＮＡ敲 低 Ｔ２４细 胞 ＦｒｋＢ基 因 表 达 ，通 过 ＭｒＩｒｒ法 、软 琼 脂 克 隆 形 成 试 验 、吖 啶橙 （ＡＯ）／溴 乙 锭 （ＥＢ）双 染 色 法 、划 痕 试验 、 Ｆｒａｎｓｗｅｌｌ试验评价靶向沉 默 ＴｒｋＢ基 因后膀胱癌 Ｔ２４细胞 的增 殖及转移侵袭 能力 ，并 以 Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹 检测其磷 脂酰肌 醇 ３激 酶（ＰＩ３Ｋ）一蛋 白激酶 Ｂ（Ａｋｔ）信号转导通路活性及 ：皮 间质转化 （ＥＭＴ）相关蛋 白的表达 水平 。结果 与 ＮＴ—ｓｉＲＮＡ组相 比，ｓｉＲＮＡ 靶 向沉默膀胱癌 ｑ＇２４细胞 ＴｒｋＢ基 因后 ，其增 殖能力 、克隆形成能力 、抗失巢 凋亡能力 、迁移及 侵袭能 力显著下 降 ，差异 有统计 学意 义 （Ｐ＜０．０５）；在 ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信号转导通路 及 ＥＭＴ的相关蛋 白中，Ｅ一钙黏蛋 白（ｃａｄｈｅｒｉｎ）的表达水平明显提高 ，而 ｐ－Ａｋｔ、Ｎ—ｃａｄｈｅｒｉｎ、波 形 蛋 白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、扭 曲 蛋 白 （Ｔｗｉｓｔ）、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ表 达 水 平 显 著 下 降 ，差 异 均 有 统 计 学 意 义 （均 Ｐ＜０．０５）。 结 论 ｓｉＲＮＡ 靶 ｒ口】沉 默 ＴｒｋＲ 叮通过降低膀胱癌 Ｔ２４细胞 ＰＩ３Ｋ—Ａｋｔ信 号转导通路 的活性进 而抑 制 ＥＭＴ，从 而降 低肿瘤细胞增殖 ，６乏转移侵袭能 力
１ 材 料和 方法 １．１ 材料 （１）细 胞株 ：人 膀胱 癌 ３＂２４细胞 购 自中 国 典型 培 养 物 保 藏 中心 （ＣＣＴＣＣ）。（２）主 要 耗 材 及 试 剂 ：超低 黏 附培 养板 购 自美 国 Ｃｏｍｉｎｇ公 司 ；人 重组 脑 源性 神经 营养 因 （ｒｈＢＤＮＦ）购 自美 国 Ｒ＆Ｄ公 司 ； ． ｐｏｆｅｅｔａｍｉｎ２０００购 自美 国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司 ；委 托 广 州 锐 博生 物科技 有 限公 司设 计 和合 成 ｓｉＲＮＡＯｌｉｇｏ；一 抗 和 二抗 均 购 自美 国 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公 司。 １．２ 细胞培 养 将膀 胱癌 Ｔ２４细胞 培 养于 含 １０％胎 牛血 清 （ＦＢＳ）的 ＲＰＭＩ１６４０培养 液 ，置 于 ３７℃ 、５％ＣＯ， 培养 箱 中培养 ，待细胞 近 ９０％ 融合 时 用 胰蛋 白酶 消化 传代 。 １．３ Ｔ２４细 胞 的 ｓｉＲＮＡ 转 染 ＴｒｋＢ（ＮＴＲＫ２）一ｓｉＲ— ＮＡ１：上 游 ５ 一ＣＣＧＵＣＡＣＣＵＵＧＡＣＵＵＧＵＣＵ３ｑ＇一３ ，下 游 ５ 一ＡＧＡＣＡＡＣＵＣＡＡＧＣＵＧＡＣＧＧＴＴ一３ ；ＴｒｋＢ（ＮＴＲＫ２）一 ｓｉＲＮＡ２：上游 ５ 一ＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＵＡＡＵＧＡＴＦ一３ ，下 游 ５ －ｕＣＡｕｕＡＣｕｕＣｕＧｕｕＣＧｕＣＧＴＴ＿３ ；ＴｒｋＢ（ＮＴＲＫ一 ２）．ｓｉＲＮＡ３：上 游 ５ 一ＧＣＧＣＵＵＣＡＧＵＧＧＵＵＣＵＡＵＡＴＦ一 ３ ，下 游 ５ 一ｕＡｕＡＧＡＡｃＣＡＣｕＣＡＡＧＣＧＣ ＩＴＩＩ．３ ；阴性 对 照组 ：上 游 ５ ．ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧｕＧＵｃＡＣＧｕ１Ｔｒ－３ ，下 游 ５ ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＴＩ＇．３ 。 按 Ｌｉｐｏｆｅｅｔａｍｉ一
化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测
中国组织工程研究与临床康复第12卷第16期 2008–04–15出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 15, 2008 Vol.12, No.16 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH3115 1College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, ChinaHao Rong-zeng★, Studying for master's degree, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; Institute of Obstetrics & Gynecology, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China rongzenghao@ Correspondence to: Ma Bao-hua, Associate professor, College of Animal Medicine, Northwest Agricultural & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi Province, ChinaSupported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30471828*; the Scientific Research Priming Foundation for Returned Persons of Ministry of Education, No. Jiaowaisiliu[2005] 383*Received:2008-01-02 Accepted:2008-02-13化学合成siRNA转染人羊膜的WISH细胞的效率检测**★郝荣增1,2，刘慧姝2，马保华1Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cellsHao Rong-zeng1,2, Liu Hui-shu2, Ma Bao-hua1AbstractAIM: Researching the pertinent literature in China Journal Full-text Database (CJFD) published between 2005 and 2008 indicatedthat the inhibitory effect of small interference RNA (siRNA) was determined by the transfection efficiency in RNA interference. Atpresent, there are few reports about detection of the transfection efficiency for human WISH cells with chemosynthesis siRNA. Inthis study， we use the flow cytometer detected the transfection efficiency and the effect on apoptosis of WISH cells after chemosynthesis siRNA transfected human WISH cells.METHODS: The experiment was performed at the Experimental Medical Research Center of Guangzhou Medical College fromMarch to December 2007. ①WISH cells were bought from Shanghai Life Science Academy of Chinese Academy Of Sciences. ②WISH cell line was transfected with CY3-Negative siRNA (0, 5, 10, 20, 30 nmol/L). Twenty-four hours later, transfectionefficiencies of different protocols were evaluated by fluorescent microscopy and flow cytometer. Apoptosis of WISH cells wasdetected with Annexin V-EGFP kit after 24-hours 20 nmol/L CY3-Negative-siRNA transfection.RESULTS: Red fluorescence was discovered under the fluorescence microscope with 5, 10, 20, 30 nmol/L CY3-Negative siRNAtransfected WISH cells, and no signals were discovered in control group. The transfection efficiency of 20, 30 nmol/L CY3-NegativesiRNA was remarkably higher than 5, 10 nmol/L CY3-Negative siRNA transfection groups (P < 0.05). There was no significant differencein transfection efficiency between 20 nmol/L and 30 nmol/L siRNA groups (P > 0.05). The apoptosis of WISH cells was detected after24-hours transfection with 20 nmol/L Negative siRNA. The apoptotic rates were 1.96% and 2.36% in the transfection and control groups,respectively. There was no significant difference in apoptosis of WISH cells between transfection group and control group.CONCLUSION：①The chemosynthesis siRNA can transfect human amnion-derive WISH cells successfully, and there is no effecton the apoptosis of WISH cells after transfection. ②Better transfection efficiency can be obtained in 20 nmol/L siRNA transfectedhuman WISH cells.Hao RZ, Liu HS, Ma BH.Chemosynthesis siRNA transfection efficiency in human amnionic WISH cells. Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(16):3115-3118(China)[/zglckf/ejournal/upfiles/08-16/16k-3115(ps).pdf]摘要目的：检索中国期刊全文数据库2005/2008相关文献显示，RNA干扰研究中，转染效率的高低直接决定siRNA 的表达效果，目前关于应用小分子干扰RNA对人羊膜WISH细胞转染效率的检测研究少见。
siRNA导入细胞的策略
siRNA导入细胞的策略siRNA导入哺乳动物细胞的策略RNAi在哺乳动物细胞中通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。
成功的进行RNAi的问题在于使siRNA导入细胞，常见的做法是将靶向特定基因的大约21碱基长短的双链siRNAs(small interfering RNAs)，或者是45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。
此外，通过质粒表达siRNAs同样可以抑制特定基因的表达。
1.1 siRNA的转染将一种特殊构建的ｓｉＲＮＡ—对称性3′突出2nt的约21nt (nucleotide)siRNAs双链复合物通过阳离子脂质体可以转入哺乳动物细胞中。
1.2 shRNA转染引入细胞45—50-mer的发夹结构RNA（small hairpin RNA, shRNA）转染到细胞。
shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。
1.3 胞内表达siRNA体内载体合成siRNA,是最近迅速发展起来的新技术。
它是2 0 0 2年2月,由Patrick等首先报道的利用载体在细胞体内稳定地表达siRNA ,从而抑制哺乳动物细胞靶基因表达的方法[1,2]。
其基本思路如下:细胞内存在RNA polymerase III,它可以识别Ｕ6启动子,从而使启动子后的基因转录成ＲＮＡ。
当模板连续出现3～5个“Ｔ”碱基时,转录就会终止。
根据这一机制,可以设计一种能表达ＲＮＡ的质粒,其组成包括四部分:①常用质粒的基本序列;②Ｕ6启动子,位于克隆位点的上游;③克隆位点;④ＲＮＡｉ模板序列(ＤＮＡ)。
这部分序列具有如下特点: 含RNAi序列,对哺乳动物而言,通常为21-23个核苷酸；发卡结构环状部分,通常有4～7个核苷酸;靶序列的反向互补序列; 3～5个核苷酸“T”。
将具有如上结构的质粒导入细胞内, 体内的RNA polymerase III就可以合成一条ＲＮＡ链,这条ＲＮＡ链可以通过两端的 2 1个左右的核苷酸反向互补特性而形成发卡样双链结构,从而起到基因抑制作用。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择
软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。
siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。
如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。
转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。
金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。
通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。
因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。
目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。
SMAD4低表达促进人血管平滑肌细胞迁移和凋亡
SMAD4低表达促进人血管平滑肌细胞迁移和凋亡殷佩;王颖;沈振亚【摘要】Objective:To observe the effect of SMAD4 gene-silence on migration and apoptosis of hu-man vascular smooth muscle cells(HASMC). Methods: HASMC was transfected with siRNA to inhibit the expression of SMAD4 gene. The migration and apoptosis of HASMC were detected by Transwell assay and flow cytometry. Western blotting assay was used to detect the effects of SMAD4 expression on apopto-sis related protein factors. Results:Compared with the negative control(NC) group,the apoptosis rate of HASMC increased significantly after siRNA-SMAD4 transfection(P<0.05).In Transwell assay,the aver-age numbers of migration cells per field in the blank group,NC group and siRNA-SMAD4 group were 19 ± 6,25 ± 7 and 114 ± 21 pa red with the blank group and NC group,there was a significant increase in the number of HASMC migration cells after transfection of siRNA-SMAD4(P<0.01).West-ern blotting experiment showed that the SMAD4 gene-silence caused cleaved caspase-3 upregulation. Conclusion:SMAD4 gene-silence significantly promotes the migration and apoptosis of HASMC,indica-ting that SMAD4 be related to the pathogenesis of aortic aneurysm.%目的:观察SMAD4表达下调对人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)迁移及凋亡的影响.方法:以siRNA-SMAD4转染HASMC,抑制SMAD4表达,以细胞迁移实验(Transwell)和流式细胞术检测平滑肌细胞的迁移和凋亡率;蛋白质印迹法检测各凋亡相关蛋白的表达.结果:与阴性对照组相比,转染siRNA-SMAD4后HASMCs 早期和晚期细胞凋亡率均明显升高(P 均 <0.05).Transwell 实验结果显示,siRNA-SMAD4组平均每视野迁移细胞数为114 ± 21,明显多于空白组和阴性对照组(分别为19 ± 6,25 ± 7,P均<0.01).蛋白质印迹结果显示SMAD4低表达引起Cleaved Caspase-3表达上调、Bal-2表达下调.结论:SMAD4低表达明显促进HASMC迁移和凋亡,有可能与主动脉瘤发生发展的病理机制相关.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(028)003【总页数】4页(P205-208)【关键词】人主动脉平滑肌细胞;SMAD4;基因沉默;迁移;凋亡【作者】殷佩;王颖;沈振亚【作者单位】苏州大学附属第一医院心脏大血管外科,江苏苏州215006;苏州大学附属第一医院心脏大血管外科,江苏苏州215006;苏州大学附属第一医院心脏大血管外科,江苏苏州215006【正文语种】中文【中图分类】R456;R543.16目前我国胸主动脉瘤与夹层的发病率呈显著上升趋势，且患者多以急性发病住院，死亡率极高。
CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响
CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响师庆红;秦迪;赵长福;张欣;杨照微;黄丽红;何成彦【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2017(021)012【摘要】目的探讨CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及细胞周期的影响.方法应用脂质体3000将CLC-3 siRNA转入PASMC.通过免疫印记法测定了CLC-3 siRNA干扰后PASMC的CLC-3表达水平;应用台盼蓝染色计数法计数了细胞增殖;流式细胞仪测定了细胞周期.结果 (1)CLC-3 siRNA可降低PASMC 的CLC-3表达;(2)CLC-3 siRNA干扰可显著抑制PASMC增殖,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P<0.05;(3)CLC-3 siRNA干扰可显著减少PASMC的S期细胞、增加G1期细胞,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P<0.05.结论CLC-3 siRNA 干扰 PASMC 表达 CLC-3,可抑制 PASMC 的增殖并影响其细胞周期进程.【总页数】3页(P2171-2173)【作者】师庆红;秦迪;赵长福;张欣;杨照微;黄丽红;何成彦【作者单位】吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院老年病科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院骨科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院老年病科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院老年病科,吉林长春 130033;吉林大学中日联谊医院检验科,吉林长春 130033【正文语种】中文【中图分类】R543.2【相关文献】1.沉默 ClC-3氯通道基因对 HeLa 细胞周期分布的影响 [J], 叶东;邢德刚;曾志;陈丽新;王立伟2.黏着斑激酶通过细胞周期蛋白依赖性激酶2、c-junN端激酶促进人肺动脉平滑肌细胞增殖 [J], 林春龙3.AMPK激动剂AICAR通过阻滞细胞周期于G0 /G1 期抑制肺动脉平滑肌细胞增殖 [J], 官文俊;许臣洪4.过表达受体活性修饰蛋白-1对人气道平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响 [J], 吴雷;叶树培;黄玉娥;陈翠仪;陈美华5.防风-乌梅含药血清对血小板衍生因子诱导人支气管平滑肌细胞增殖与细胞周期的影响机制研究 [J], 龙声志;吴贤波;朱海燕;陈林;谢毅强;杨帆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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镜 （ Ｏ ｌ ｙ ｍ ｐ ｕ ｓ 公 司） ，Ｃ Ｃ Ｋ ８（ 碧云天公 司 ） ，ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ由 Ａ ｍ — ｂ ｉ ｏ ｎ公司根据要求化学合成 。
１ ． ２ 方 法
达 ，ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ必须进 入 细 胞 后 才 能发 挥 其 对 基 因 的沉 默 作
Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｆ ａ ｅ ｔ ｏ ｒ ｓ（ 含有 ｒ ｈ Ｆ Ｇ Ｆ ０ ． ５ ｍ Ｌ ５ ｎ ｇ ／ ｍＬ ；ｒ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｕ ｌ ｉ ｎ ０ ． ５ ｍＬ
５ ｇ ／ ｍＬ； Ａ ｓ ｃ ｏ ｒ ｂ ｉ ｃ Ａｃ ｉ ｄ ０ ． ５ ｍＬ ５ ０ ｇ ／ ｍＬ； Ｌ — Ｇｌ ｕ ｔ ａ ｍｉ ｎ ｅ ２ ５
血清 液体 培 养 基 （ Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ公 司 ） ，Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ｅ ｃ ｔ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ Ｒ Ｎ Ａ ｉ — Ｍ Ａ Ｘ
（ Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ公 司 ） ，９ ６孑 Ｌ 板 （ Ｃ ｏ ｍｉ ｎ ｇ公 司 ） ，荧 光 倒 置 显 微
ｍＲ Ｎ Ａ完全互补配对 ，继 而引发 靶 ｍ Ｒ Ｎ Ａ的降解 、抑制靶
理 想的转染效果。
【 关键词 】 人肺动脉平滑肌 细胞
ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 转 染
Ｄ ＯＩ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０— ８ ５ ３ ５ ． ２ ０ １ ４ ． ０ ２ ． ０ ２ ４
ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ是指小 干扰 Ｒ Ｎ Ａ （ ｓ ｍａ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｒ Ｎ Ａ，ｓ ｉ Ｒ — Ｎ Ａ）在进入细胞后 ，通过碱基互补 配对 的原则与 靶基 因的
采 用化 学合 成的能够抑制管 家基 因表达 的 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ，以 ０ ，５，１ ０ ，１ ５ ，３ ０ ｎ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 浓度 ，应 用脂质 体 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ — ａ ｍ ｉ ｎ ｅ Ｒ Ｎ Ａ ｉ ＭＡ Ｘ转染人肺 动脉 平滑肌 细胞 ，转染 ４ ８小时后 通过显微镜观察和 Ｃ Ｃ Ｋ 一 ８检 测细胞 的增殖情况 ，评 估转染 效率。结果 对照组细胞生长正常 ，在不 同转染浓度下 ，细胞的 生长情况 受到 不同程度 的影 响。试剂 对照组与 空 白对 化 学合 成的 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ可 以在 １ ０ ｎ ｍ ｏ ￣Ｌ的浓度 即可获得
般 的瞬时转染多采用 脂质 体法 ，阳离 子脂质 体法 是操作
简便 ，低 毒高效的转染方 法之一 Ｊ ，目前广 泛的应 用于将 外 源基因导入真核细胞 的各类 实验 中 ，但在转 染原 代细 胞 时存 在效 率低 下的问题 ，Ｒ Ｎ Ａ ｉ 技术 的应用 因其转染效率低
ｍ Ｌ １ ０ ｍ Ｍ；ｒ ｈ Ｅ Ｇ Ｆ ０ ． ５ ｍＬ ５ ｉ ｒ ｇ ／ ｍＬ ；Ｆ Ｂ Ｓ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ２ ５ ｍ Ｌ ）
的Ｖ ａ ｓ ｃ ｕ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ Ｍ Ｃ完全培 养液 ，置 ５％Ｃ Ｏ ： ，３ ７ ℃恒 温箱 中 培养 。转染 当天 ，常规 收集对数 生长 期状 态 良好 的细胞 ，
下而受到限制 ；逆转 录病 毒是 目前效 率最 高 的转 染 载体 ，
但 由于其价格 昂贵且耗 时较 长而不作 为实 验 的首选 。近 期 Ｎ ｏ ｈ ｅ Ａ等人研究发现反 向转染法 可以提 高原 代 内皮 细胞 转 染效 率 ，但 该方法是否适用于原代平滑肌细胞 尚无报 道。 基因组功能研究 中 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ是一个有 力工具 ，多孔 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 反 向转染法逐渐成为分 析信号 通路 的高效 而有力 的工 具 ，为 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ转染原代 细胞及 应用 Ｒ Ｎ Ａ ｉ 技 术进行 体 外研 究提 供 实验依据 Ｊ 。本研究采用 反 向转染 法转 染人肺 动脉平 滑肌
温箱 中待用 。
１ ． ２ ． ２ ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 反 向转 染 分别 配 置 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 混合 物 和转 染 试剂 Ｌ ｉ ｐ ｏ ｆ ａ ｃ ｅ ｔ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ
照组 （ ０ ｎ ｍ ｏ ￣Ｌ组 ） 细胞 增 殖 无 差 异 （ Ｐ＞ ０ ． ０ ５ ） ，１ ０ ｎ ｍ ｏ ￣Ｌ以 上 浓 度 组 的 转 染 效 率 显 著 高 于 ５ ｎ ｍ ｏ ￣Ｌ组 （ Ｐ＜０ ． ０ ５ ） ，
１ ０ 、１ ５和 ３ ０ ｎ ｍｏ ￣Ｌ组转 染效 率差异 不显著 （ Ｐ＞０ ． ０ ５ ） 。结论
・
６ Ｏ・
广
州
医
药
２ ０ １ ４年第 ４ ５卷第 ２期
ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ反 向转 染 人肺 动 脉 平 滑肌 细胞 的条 件 优化
赵 壶 白振 忠 苏效 东 西宁 ８ １ ０ ０ ０ １ ）
【 摘要】 目的 寻找小分子干扰 Ｒ Ｎ Ａ转染人肺动脉平滑肌细胞的的最佳条件 ， 建立有效的转染体 系。方法
细胞 （ Ｈ Ｐ Ａ Ｓ ＭＣ ） ，优 化 转 染 体 系 探 索 人 肺 动 脉 平 滑 肌 细 胞
加入适量不含抗生素和血清 的 Ｖ ａ ｓ ｃ ｕ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ＭＣ培养基将细胞
稀释到 １ ． ２×１ ０ ／ ｍ ｌ ，制 成 细 胞 悬 液 ，置 ５ ％Ｃ Ｏ ２ ，３ ７ ｑ Ｃ恒
用 … ，其效果取决 于进 入细胞 内部 的 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 的多少 ，转染 效率 的高 低直 接决 定 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 的效 果 。对 于 多数细 胞而 言 ，
一
１ ． ２ ． １ 细胞 的准备
常 规 复 苏 ＨＰ Ａ Ｓ ＭＣ 细 胞 ，用 添 加 了 Ｖ ａ ｓ ｃ ｕ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ＭＣ