平滑肌细胞培养实验步骤解读
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
平滑肌细胞培养方法
平滑肌细胞培养方法
1.平滑肌细胞培养基本介绍
平滑肌细胞是一种广泛存在于人体的微小细胞，它们在舌头、咽喉、唾液腺、支气管、胃肠道等部位有分布。
主要作用是运输氧气，调节呼吸、控制血管压力，调节胃肠道收缩等。
平滑肌细胞在心血管病、恶性肿瘤、胃肠道疾病及甲状腺功能紊乱方面有诸多应用，因此，平滑肌细胞的培养方法十分重要。
2.平滑肌细胞培养步骤
（1）切取肌组织，从人体和动物肠道中切取肌肉组织，如舌苔腺或食管。
（2）洗涤组织：将取出的肌肉组织放置于容器中，加入能够破坏真菌等细菌的生物消毒液，用弱酸
洗涤细胞。
（3）离心：将洗涤过的肌组织穿过45μm滤网，净化血清及消毒液，用1000-3000×g的离心力、37℃的低温离心过滤和洗涤，保证细胞的活性。
（4）脱管：将离心过滤和洗涤过的细胞放入培养管中，用0.125%葡萄糖胰酶液将细胞脱管，然后20%牛血清 or 小鼠血清分散离细胞，取离心的物质收集细胞悬液。
3.平滑肌细胞培养培养基的配制
（1）细胞培养基的选择：具有细胞活力的DMEM、RPMI-1640等哺乳动物细胞培养基可以
分别作为基础培养基。
（2）培养基中添加抗生素：如卡那霉素、链霉素、林可霉素等，防止杂菌污染。
（3）添加特定生长因子：如胰岛素、EGF、HCF 等，以促进细胞生长。
平滑肌细胞培养实验步骤解读
平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。
肺动脉平滑肌细胞原代培养原代培养
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。
2、 75％消毒用酒精2瓶，5%碘酒1瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，M199培养基100ml（含4mmol/L 的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。
3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，1ml 吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。
二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。
2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。
3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。
4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。
左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。
打开紫灯消毒30min。
5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。
6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。
7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。
8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。
9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS 冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。
大鼠血管平滑肌细胞的培养
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平滑肌细胞传代
传代时间：大部分组织块长出细胞晕， 并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
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传代步骤：
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank’s液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平 放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞 消化情况，可见到细胞质回缩，细胞 间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞 脱离消化液
大鼠血管平滑肌细胞的 培养
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相关帮助
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0.10
NaCl
8.0
NaHCO3 Na2HPO4.12H2O D-glucose
0.35 0.12 1.0
Phenol red
0.01
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13
将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中， 其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混 匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定
容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟， 4℃冰箱保存。
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血管平滑肌细胞的冻存和复 苏
冻存时间：较早期传代，以防细胞因 为传代次数过多而造成细胞衰老或发 生改变，以保持实验条件的一致性。
冻存方法：冻存前24小时更换培养液， 冻存时要将密闭好的冻存管依次放于：
4ºC
2小时
-20ºC 2.5小时
人脑血管平滑肌细胞培养
1100Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells人脑血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。
血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。
最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息.细胞培养说明注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。
将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。
经过以下步骤后开始培养细胞1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。
向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时)2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。
在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。
用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。
3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。
将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。
4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。
将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。
小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。
用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。
5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。
推荐接种密度为5,000 cells/cm2。
注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。
血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。
人主动脉血管平滑肌细胞提取
人主动脉血管平滑肌细胞提取
1. 实验器材准备，准备好所需的培养皿、离心管、各种培养基和消化酶等实验器材。
2. 组织样本获取，从人体捐赠者或手术获取的组织样本中，选择主动脉组织进行提取。
确保样本来源合法，并且符合伦理标准。
3. 组织处理，将主动脉组织迅速转移到无菌的条件下，用生理盐水或其他缓冲液清洗组织，去除血液和杂质。
4. 细胞分离，使用适当的消化酶（如胰酶）对组织进行消化，以分离出平滑肌细胞。
消化时间和酶的浓度需要进行优化，以确保细胞的完整性和纯度。
5. 细胞培养，将分离得到的平滑肌细胞接种到培养皿中，使用适当的培养基进行培养。
培养条件需要控制温度、湿度和二氧化碳浓度等参数。
6. 细胞鉴定，通过形态学观察和特异性标记物的免疫细胞化学染色等方法，对提取得到的细胞进行鉴定，确保其为主动脉平滑肌
细胞。
7. 细胞保存，根据需要，可以将提取得到的细胞进行冻存，以备后续实验使用。
总的来说，人主动脉血管平滑肌细胞的提取是一项复杂的实验技术，需要严格控制实验条件和遵守相关伦理规范。
通过精心设计实验方案和严格执行操作流程，可以获得高质量的细胞样本，为心血管疾病研究提供重要的实验材料。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-最新年精选文档
[1] 。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。
在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。
本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。
1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。
动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。
DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。
转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。
放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。
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原代平滑肌细胞培养Protocol
实验准备：
器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套
试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精
步骤：
1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；
2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；
3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；
4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；
5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；
6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；
7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；
8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。