实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌提取DNA
中文摘要目的：用试剂盒法和碱法提取p16重组质粒的比较。
方法：1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。
结果：碱裂法的OD值分别为：1.583；1.575；1.735，质粒DNA的浓度为：3.060；3.150；2.370。
试剂盒法的OD（260/280）值为：1.614；1.605；1.656。
质粒DNA的浓度为：；0.390；0.420；0.600。
结论：碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。
试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。
关键词：质粒；试剂盒法；碱法；AbstractPurpose : Draw the comparison that p16 recombinated the plasmid with the reagent box law and alkali law. Method : 1. 5ml fungus liquid move in 50mlLB liquid culture train 12h, reagent box law and alkali law all 3 group, every group joins 3. The fungus liquid of 0ml, there are two groups that are tested by the contrast in each kind of method; The law of purple other spectrophotometer examines OD value; The enzyme is cut; Agar-agar candy gel electrophoresis. Result: It split alkali OD the law one including: 1. 583; 1. 575; 1. 735, the density of plasmid DNA is: 3. 060; 3. 150; 2. 370. Whether reagent OD (260/280), box of law value is. 1. 614; 1. 605; 1. 656. The density of plasmid DNA is: ; 0. 390; 0. 420; 0. 600. Conclusion: Alkali law and reagent box law analyse with statistics that there is not remarkable difference. The reagent box law is simple , swift, DNA is high in purity , but the density of plasmid DNA is low, there is little quantity of drawing plasmid DNA, and the reagent box costs an arm and a leg, the alkali law is cheap, the density of plasmid DNA is high, there is much quantity of drawing plasmid DNA, so have stronger practicability, suitable for the research work of general laboratory .Keyword: Plasmid; Reagent box law; Alkali law;前言P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。
大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)报告
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型， 是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒类型：
按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒
1. 松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依 赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制， 质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体 复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达20003000拷贝。
分钟。
四、操作步骤
6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1), 振荡混匀,4℃下12000g离心 5min。 7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中15分钟， 然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加 入1ml 70％乙醇洗沉淀一次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10分钟或室温干燥。
二实验原理?使蛋白质或脂类等菌体成分变性?基因组dna产生缺刻变成线状并解离成单链变性?由于质粒dna较小仍为环状变性区虽大但不分离利用强碱或加热及表面活性剂sds裂解菌体中和或恢复至室温?变性的质粒dna按原互补配对结构复性?基因组dna随机复性与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离?质粒dna存在于上清中回收?苯酚氯仿异戊醇抽提乙醇沉淀纯化二实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的
pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清 中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
实验二细菌基因组DNA的提取
4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24： 1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提 两次）
DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1） 抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。
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核酸样品的保存
温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存
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DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA 或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使 DNase失活。
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RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作
⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
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四、注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量 少，纯度低
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
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核酸制备中常用的蛋白质变性剂
1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造 成蛋白污染。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
实验分子生物学实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。
在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。
而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
分离目的基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。
通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。
二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。
实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。
2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。
3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。
4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。
2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。
四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。
（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。
2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。
（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。
（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。
3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。
（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。
4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。
（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。
（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。
五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。
2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。
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大肠杆菌基因组DNA的提取
1．吸1ml大肠杆菌DH5α至1.5 ml离心管中，10000rpm离心30秒；
2．吸干上清液，菌体充分悬浮于0.5 ml裂解液（10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, pH8.0）;
3．加12.5 μl 10 mg/ml proteinase K, 混匀，37℃水浴1小时；4．加250 μl 6 M NaCl, 剧烈振荡30秒；
5．冰浴10 min后9500rpm离心10min;
6．转移500 μl上清至1.5 ml离心管中，加1 ml无水乙醇，颠倒混匀直至看清沉淀；
7．10000rpm离心5min, 吸干上清，沉淀溶于300μl水中；8．加15μl 2 mg/ml RNaseA, 混匀，37℃水浴1小时；9．加150μl饱和酚及150μl氯仿，振荡10秒后10000rpm 离心1 min；
10．上清转移到1.5 ml离心管中，加2.5倍体积无水乙醇,混匀；11．10000rpm离心2min, 吸干上清，沉淀用0.5 ml 70%乙醇洗涤一次，吸干乙醇，室温晾干(~10 min)；
12．沉淀溶于300μl水中，取10μl电泳观察，其余置-20℃冻存备用。