大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
DNA提取及PCR扩增实验报告
PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。
2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。
二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。
在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。
降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。
溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。
如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。
经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。
2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。
DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。
不同构型的DNA分子的迁移速度不同。
该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。
试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。
四、实验步骤1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
实验分子生物学实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取生技基地实验目的与要求以大肠杆菌培养物为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
实验原理基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。
在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。
一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR 所扩增的片段（一般2kb以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
常规实验中从细菌基因组上PCR扩增目的基因时，一般所用的DNA量较少，可以采用较简单的沸水浴裂解法制备少量的DNA。
在短时间的热脉冲下，细胞膜表面会出现一些孔洞，此时就会有少量的染色体DNA从中渗透出来，然后离心去除菌体碎片，上清中所含的基因组DNA即可用于PCR模板。
而对于大量的基因组DNA制备（如Southern Blotting，需大量基因组），可采用试剂盒抽提。
应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法
７３４第２８卷第７期第三军医大学学报Ｖ０１．２８，Ｎｏ．７２００６年４月ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＭＩＬＩＴＡＲＩＳＴＥＲＴＩＡＥＡｐｒ．２００６整㈤莹藏泰｝穷法銎攀型｜｜应用于ＰＣＲ及实时荧光定量ＰＣＲ的细菌ＤＮＡ提取方法文章编号：１０００－５４０４（２００６）０７－０７３４—０２胡晓红１，刘昕２，黄正根２，彭惠民１，袁科２，程英２，高云２（１重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室，重庆４０００１６；２第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室，重庆４０００３８）提要：目的建立特异灵敏的适应于ＰＣＲ及实时荧光定量ＰＣＲ的细菌ＤＮＡ提取方法。
方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液（２５％Ｃｈｅｌｅｘ一１００，０．５％ＮＰ４０，ＴＥ配制，ｐＨ＝９．０）；５６ｏＣ孵育３０ｍｉｎ；１００℃水浴１０ｍｉｎ；离心后所得上清即为ＤＮＡ。
电泳、ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ扩增评价该方法的特异性及灵敏度。
结果本方法所提细菌ＤＮＡ电泳条带清晰，未见假阳性，Ｄ（２６０）／Ｄ（２８０）＝（１．７９±０．０３）；ＰＣＲ及Ｒｅａｌ。
ｔｉｍｅＰＣＲ扩增未见假阳性及假阴性，灵敏度达１０１／ｍｌ细菌浓度。
结论本研究细菌ＤＮＡ提取方法特异灵敏，适应于ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ。
实时荧光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ）技术及一些防污染措施克服了ＰＣＲ中假阳性的问题，但是作为高灵敏度的扩增技术¨１，ＰＣＲ及Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰＣＲ在应用中却仍存在假阴性的问题，究其原因主要是靶序列的获得不够灵敏，ＤＮＡ未完全暴露。
２Ｊ。
为此我们以细菌为样本，建立了特异灵敏的ＤＮＡ提取方法，以使ＰＣＲ及Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰＣＲ得到更好的应用。
１材料与方法１．１材料１．１．１菌种实验所有细菌菌种为西南医院检验科惠赠，哥伦比亚血平板（庞通公司）培养，挑出单菌落，用双蒸水１：１０倍比稀释，取低浓度菌液涂布于血平板，以计数。
实验一大肠杆菌DNA的提取
大肠杆菌总DNA的提取
实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1. 掌握DNA提取的原理和方法；
2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
实验材料：
1.实验菌株：大肠杆菌
2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，
20% SDS：
溶菌酶（50mg/ml）
5M NaCl
氯仿：异戊醇（24：1 v/v）
无水乙醇
0.8%琼脂糖
TAE电泳缓冲液
仪器：离心机，电泳仪
实验步骤：
1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；
2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；
3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min；
4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；
6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，
吸取上清于一新离心管中；
7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min；
8)弃上清，离心管在空气中自然晾干；
9)加入30-40ul TE溶解DNA；
10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。
(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
大肠杆菌dna提取实验报告
大肠杆菌DNA提取实验报告一、引言DNA（脱氧核糖核酸）是构成生物体遗传信息的重要分子，通过提取DNA，可以进行一系列的遗传学研究和实验。
大肠杆菌（Escherichia coli）是常见的一种细菌，它在基因工程和生物技术中具有重要的应用价值。
本实验旨在通过提取大肠杆菌的DNA，了解提取过程及其在实验中的应用。
二、理论基础2.1 DNA提取的原理DNA提取是通过物理、化学等方法将生物样品中的DNA分离出来的过程。
DNA提取的基本步骤包括细胞破碎、蛋白质和RNA去除以及DNA沉淀等。
2.2 大肠杆菌DNA结构大肠杆菌的DNA为环状双链结构，由四种碱基组成：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。
DNA分子具有一定的长度和序列，不同的DNA分子序列决定了不同的遗传特征。
三、实验材料与方法3.1 实验材料•大肠杆菌菌液•细胞裂解液•蛋白酶K•异丙醇•氯仿•氯化钠溶液•等温离心管•离心机•丙酮3.2 实验方法1.取适量的大肠杆菌菌液。
2.向细胞裂解液中加入适量的蛋白酶K。
3.在60摄氏度水浴中孵育30分钟。
4.加入等体积的氯仿，并充分混合。
5.离心分离水相和有机相。
6.将上清转移至新的离心管中。
7.加入等体积的异丙醇，并充分混合。
8.离心分离水相和有机相。
9.除去上清，加入氯化钠溶液，混匀。
10.加入等体积的冷异丙醇，混合后离心。
11.除去上清，加入丙酮洗涤。
12.最后离心去除丙酮。
四、实验结果与分析4.1 DNA提取过程观察在实验过程中，观察到细胞裂解液与大肠杆菌菌液接触后，出现了白色混浊的现象。
随着实验进程的推进，通过离心可以看到分离出的水相和有机相，其中水相呈现透明状，而有机相则呈现为混浊的白色液体。
4.2 DNA纯度检测通过使用紫外-可见分光光度计对提取得到的DNA进行检测，测得的吸光度比值（A260/A280）为1.8，表明DNA的纯度较高。
4.3 DNA浓度测定利用光度法对提取得到的DNA溶液进行浓度测定，测得DNA浓度为50 ng/μL。
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取
1．吸1ml大肠杆菌DH5α至1.5 ml离心管中，10000rpm离心30秒；
2．吸干上清液，菌体充分悬浮于0.5 ml裂解液（10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, pH8.0）;
3．加12.5 μl 10 mg/ml proteinase K, 混匀，37℃水浴1小时；4．加250 μl 6 M NaCl, 剧烈振荡30秒；
5．冰浴10 min后9500rpm离心10min;
6．转移500 μl上清至1.5 ml离心管中，加1 ml无水乙醇，颠倒混匀直至看清沉淀；
7．10000rpm离心5min, 吸干上清，沉淀溶于300μl水中；8．加15μl 2 mg/ml RNaseA, 混匀，37℃水浴1小时；9．加150μl 饱和酚及150μl氯仿，振荡10秒后10000rpm 离心1 min；
10．上清转移到1.5 ml离心管中，加2.5倍体积无水乙醇,混匀；11．10000rpm离心2min, 吸干上清，沉淀用0.5 ml 70%乙醇洗涤一次，吸干乙醇，室温晾干(~10 min)；
12．沉淀溶于300μl水中，取10μl电泳观察，其余置-20℃冻存备用。
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大肠杆菌基因组DNA得提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。
在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1)实验材料:大肠杆菌2)实验试剂:LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5g/L,NaCl 10g/L,去离子水。
(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml 摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、)2)TE缓冲液:1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20℃备用)4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到65℃使之溶解,然后室温保存)4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。
2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。
5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。
6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心10min8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10min9、取上清液,加入300ul得异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中,20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒:1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP30202 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650元3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒GD241101 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD241102 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210元D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元D335002 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 200 3350元荧光定量PCR试验(标准曲线法) 定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR) 得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。
其中靶可以就是 DNA、 cDNA 或 RNA。
【实验原理】在实时定量实验中,反应就是在PCR 产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得PCR 产物最终数量来描述。
扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。
在PCR 得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。
该预定义得PCR 循环范围称为基线。
首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度(与基线循环相对应得 Rn 值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。
然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn [∆Rn] 值)与阈值交叉得点。
∆Rn 值与阈值交叉得分数循环定义为 CT。
一、试验设计使用StepOne软件中得Design Wizard(设计导向)创建新实验1、定义实验属性在Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验得标识信息,然后选择要设计得实验类型。
1)Experiment Name (实验名称)。
2)Barcode (条码),然后输入您得 PCR 反应板上得条码。
(可不填)3)User Name (用户名)。
4)ments (注释)。
(可不填)5)选择Quantitation (定量)实验类型6)Next> (下一步)2、定义方法与材料在Methods & Materials (方法与材料)屏幕上,选择用于实验得定量方法、试剂、升降温速度与 PCR 模板。
1)将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。
将Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。
标准曲线实验确定样本中靶序列得绝对量。
从已知量得稀释序列中构建得标准曲线用于归档结果。
当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品与样本。
用于标准曲线实验得 PCR 反应包括以下组分:• 样本－其中靶数量未知得样本。
• 标准品－数量已知得样本。
• 标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线得标准品稀释液 (例如,1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。
• 重复数－含有相同组分与量得相同反应数。
• 阴性对照－含有水或缓冲液得样本,不含模板;也称为“无模板对照(NTC)”。
阴性对照应不会扩增。
2)为试剂选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。
–如果使用TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂) 。
TaqMan 试剂包括两个引物与一个TaqMan® 探针。
引物设计用于扩增靶。
TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。
切记！Applied Biosystems 不建议将TAMRATM 染料随StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。
–如果使用SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择SYBR® Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。
SYBR Green 试剂包括两个引物与SYBR Green 染料。
引物设计用于扩增靶。
SYBR Green 染料可在结合到双链DNA 时产生荧光信号。
SYBR Green 染料通常就是添加到反应得SYBR Green 母液得一部分。
如果使用SYBR Green 染料:选择Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶得解链曲线分析。
将Standard (标准)选为升降温速度。
Applied Biosystems 不提供SYBR Green 试剂得 Fast 母液。
3)为升降温速度选择Standard (~2 hours to plete a run) (标准 (约两小时完成运行)) 。
–如果为PCR 反应使用Fast 试剂,则选择Fast (~40 Minutes to plete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。
–如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂与 TaqMan 试剂) ,则选择Standard (~2 Hours to plete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行)) 。
4)为模板类型选择gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。
5)Next> (下一步) 。
3、设置靶在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量得靶数量,然后为每个靶设置检测。
1)单击How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶？)字段,然后输入1(根据需要填)。
注意: 靶检测表中得行数将以您输入得数字更新。
2)选择Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。
建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线。
注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。
3)设置靶 1 检测:a、单击Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入RNase P(示例)。
b、从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择FAM (默认) 。
–如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得5′ 端,则选择FAM。