双底物酶促反应动力学机理
生物化学(第三版)第九章 酶促反应动力学课后习题详细解答_ 复习重点
第九章酶促反应动力学提要酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率各种因素的科学。
它是以化学动力学为基础讨论底物浓度、抑制剂、pH、温度及激活剂等因素对酶反应速率的影响。
化学动力学中在研究化学反应速率与反应无浓度的关系时，常分为一级反应、二级反应及零级反应。
研究证明，酶催化过正的第一步是生成酶-底物中间产物，Michaelis-Menten该呢举中间产物学说的理论推导出酶反应动力学方程式，即Km、Vmax、kcat、kcat/Km。
Km是酶的一个特征常数，以浓度为单位，Km有多种用途，通过直线作图法可以得到Km及Vmax。
Kcat称为催化常数，又叫做转换数（TN值），它的单位为s-1，kcat值越大，表示酶的催化速率越高。
kcat/Km常用来比较酶催化效率的参数。
酶促反应除了单底物反应外，最常见的为双底物反应，按其动力学机制分为序列反应和乒乓反应，用动力学直线作图法可以区分。
酶促反应速率常受抑制剂影响，根据抑制剂与酶的作用方式及抑制作用是否可逆，将抑制作用分为可逆抑制作用及不可逆抑制作用。
根据可逆抑制剂与底物的关系分为竞争性抑制、非竞争性抑制及反竞争性抑制3类，可以分别推导出抑制作用的动力学方程。
竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，其动力学常数Kˊm变大，Vmax不变；非竞争性抑制Km不变，Vˊmax变小；反竞争性抑制Kˊm及Vˊmax均变小。
通过动力学作图可以区分这3种类型的可逆抑制作用。
可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制，过度态底物类似物为强有力的竞争性抑制剂。
不可逆抑制剂中，最有意义的为专一性Ks型及kcat型不可逆抑制剂。
研究酶的抑制作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制、阐明代谢途径以及设计新药物的重要手段。
温度、pH及激活剂都会对酶促反应速率产生重要影响，酶反应有最适温度及最适pH，要选择合适的激活剂。
在研究酶促反应速率及测定酶的活力时，都应选择酶的最适反应条件。
习题1.当一酶促反应进行的速率为Vmax的80%时，在Km和[S]之间有何关系？[Km=0.25[S]]解：根据米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：0.8Vmax=Vmax[S]/(Km+[S])Km=0.25[S]2.过氧化氢酶的Km值为2.5×10-2 mol/L，当底物过氧化氢浓度为100mol/L时，求在此浓度下，过氧化氢酶被底物所饱和的百分数。
4 酶促反应动力学
中间产物假说证据：
（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性 （3）结晶ES复合物的获得。(4)底物和酶共沉降 （5） ES复合物被电子显微镜或X-射线衍射法观 察到。
（二）. 酶促反应动力方程式
1、米式方程
[S]:底物浓度;
V:不同[S]时的反应速度; Vmax:最大反应速度(maximum velocity); Km:米氏常数(Michaelis constant)。 (不是反应平衡常数）
Vmax/2时, Km ＝[S], Km必须对细胞内的正常[S]有某种关
系。一种能与以很低的浓度存在于细胞中的底物作用的酶, 倾向于有较低的Km(与该酶处在正常丰度的底物下相比)。对
于讨论催化效率来说, 最有用的参数应该包含kcat和Km两者。
3、Km和Vmax值的测定
(1) 以v-[S]作图，可以得到Vmax，再从1/2 Vmax，
（2）. Vmax与K3（Kcat）的意义
Vmax（不是酶的特征常数） maximum velocity
① 定义:是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比. ② 意义:Vmax=K3 [E] （k3是一级反应速率常数）
如果酶的总浓度已知,可从Vmax计算 酶的转换数即动力
学常数K3
Catalytic constant
理论基础：中间产物学说
假设：反义速率(v)和[ES]成正比 发展: (1) 最初.Michaelis和Menten 是根据“快速平衡 假说” 推出米式方程。 (2) 以后.Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对
米式
方程的发展：
（一） 中间复合物假说
中间产物学说认为：当酶催化某个反应时, 酶和底 物先结合形成一个中间复合物, 然后中间复合物再分解, 生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个 酶催化反应速度，而产物的生成取决于中间物的浓度. 因此, 整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度.
酶促反应动力学
第一节 酶促反应的动力学方程
一、化学动力学基础
1、反应分子数和反应级数 1）反应分子数
指在反应中真正相互作用的分子数。
A
P
A+B
P+Q
2）反应级数
指实验测得的反应速率与反应物浓度之间的关系，符合 哪种速率方程，则这个反应就是几级反应。
蔗糖 + H2O 蔗糖酶 葡萄糖 + 果糖
1
3）零级反应的特征
反应速率与反应物浓度无关。初始浓度增加，反应速度不变， 要使反应物减少一半所需完成的反应量增加，因此最后表现为半 衰期与初始浓度成正比。
二、底物浓度对酶促反应的影响
1、酶促反应初速度与底物浓度之间的关系 1903年Henri以蔗糖酶水解蔗糖为例，研究底物浓度与酶促反
应速度之间关系时，发现两者的关系符合双曲线关系。
k2
Km= (k2+k3)/k1
Km是[ES]的分解常数与生成常数的比值。 Km的真正含义是， Km越大意为着[ES]越不稳定，越容易分解。但不能说明[ES]是容 易分解成底物还是产物。
kcat/Km可表示为 [k3/(k2 + k3)]k1， k3/(k2 + k3)代表[ES] 分解成产 物的分解常数占[ES] 总分解常数的比值。 k3/(k2 + k3)越大，说明 [ES]越容易分解成产物。 k1是[ES] 生成常数。因此， kcat/Km数 值大不仅表示[ES]容易生成，还表示[ES]易分解成产物。真正代 表酶对某一特定底物的催化效率。所以，也称为专一性常数。 极限值是k1 ，意为[ES]不会再分解为底物。
酶的化学本质是蛋白质，因此，酶 对温度具有高度的敏感性，随着温度 的升高，分子的构象会逐渐地被破 坏，失去催化活性。
生物体内酶促反应的动力学研究
生物体内酶促反应的动力学研究生物体内酶促反应是生命活动中至关重要的一环。
酶作为催化剂，能够加速化学反应的速度，从而使生物体内的代谢过程得以迅速而高效地进行。
酶促反应的动力学研究是对生物体内代谢过程的理解和探索，也是对生物科学的重要贡献。
本文将探讨酶促反应的动力学研究相关的知识和方法。
一、酶促反应的动力学基础酶促反应的速率受到多方面因素的影响，其中包括底物浓度、酶浓度、反应温度、pH值等因素。
酶速率和底物浓度之间呈线性关系，在底物浓度较低时，速率只受酶浓度的影响。
酶浓度和速率呈正比关系，但随着酶浓度的增加，速率会逐渐趋于饱和，即速率不再随酶浓度的增加而增加。
反应温度对酶的活性具有双重性，即温度升高对酶的催化活性起促进作用，但过高的温度会破坏酶的三级结构，导致失活。
酶对pH值的敏感度也较高，大多数酶的最适pH值不同，而且对于同一酶而言，不同亚型在最适pH值上也可能存在差异。
二、酶促反应动力学研究的方法目前，酶促反应动力学研究的方法主要包括比色法、荧光法、放射性同位素标记法等。
其中，比色法是一种常用的测定酶活性的方法。
比色法根据酶促反应所产生的产物的特定吸收波长的变化来反映酶活性的变化。
荧光法是一种基于酶促反应产生的荧光信号变化来测定酶活性的方法。
该方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，但需要使用荧光探针，具有一定的成本和复杂性。
放射性同位素标记法是一种使用放射性同位素标记底物或产物来测定酶活性的方法。
该方法具有高灵敏度和准确性，但难以普及应用，并且存在较高的辐射风险。
三、酶促反应动力学研究在生物科学中的应用酶促反应动力学研究在生物科学研究中起到了重要的作用。
通过对酶促反应的动力学特性的分析，可以帮助我们深入了解生物体内的代谢过程和生物体内化学反应的本质。
此外，酶动力学研究也有助于开发新的药物和治疗方法，如开发针对特定酶的抑制剂和激动剂，以及针对酶催化剂的重组蛋白和抗体等。
结语生物体内酶促反应的动力学研究是生物科学的重要分支领域，其研究成果对于理解生物体内代谢过程和开发新药物具有重要的作用。
04酶促反应动力学
(二) 前稳态动力学与稳态动力学的比 较
时间 反应速度 反应步骤 前稳态动力学 稳态动力学 0~t1 t1~ t2 d P d S d ES 常数 dt dt dt k1 k2 ES E S ES E P k -1
二、单底物酶促反应稳态动力学
k2 E S ES E P k1 k -1
ES(酶-底物复合物)生成速度 d S k1 E S dt ES分解速度= k 1 ES k 2 ES ES净生成速度
d ES dt
=ES生成速度-ES分解速度
t=0, [ES]=0, [P]=0, [S]最 大,ES生成速度最大, 0~t1内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] ↗, 到t1时,达到恒定. ES生成速度↘, ES分解速 度↗, ES净生成速度↘ t1~ t2内, [S] ↘, [P] ↗, [ES] → (稳态或恒态) ES生成速度= ES分解速度, ES净生成速度→ T2后, [ES] ↘
零级反应
混合级反应 一级反应
S K m , S
K m ,
（1）酶反应的反应速度和底物浓度直接相 关； （2）底物浓度决定着酶系统的反应级别； （3）衡量这种关系的尺度是Km；
米氏方程概括的这些规律和绝大多数实验结 果一致，但少数情况下产生异常。例如，1/v 对1/[S]作图时，一般应该得到线性图形，但 有时也会产生偏差，原因可能为：
K m S
V S
或
（二）米氏方程的物理意义 1.提供了两个极为重要的酶反应动力学常数Km和可擦他kcat 并通过他们表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间 的关系。 Km的物理意义： ⑴特定的反应，特定的反应条件下，Km是个特征常数，可部 分描述酶反应性质、反应条件对酶反应速度的影响。故可用 来鉴别不同的酶。 ⑵1/Km表示酶与底物的亲和力，Km越大，亲和力越小，反之 越大。 ⑶当v=V/2时，Ks=[S]。表明Km相当于反应达到最大速度一 半时的底物浓度，或者说，相当于要使反应系统有一半的酶 分子参加反应所必须具有的底物浓度。 ⑷通过Km可判断酶的最适底物，因为最适底物具有最大的 V/Km。 ⑸通过Km可了解酶的底物在体内可能具有的浓度水平。一般 酶<<Km,那么v<<V,大部分酶处于浪费状态; 反之,如果[S] >>Km,那么v≈V，[S]将失去其生理意义。 ⑹通过体外测定某些物质对Km的影响，可以推断出该物质可 能有的生理效应，如作为抑制剂或活化剂等。
酶促动力学
H C
S CHCl E S As
H C
CHCl + 2HCl
巯基酶
S E S
路易士气
H2C SH
失活的酶
酸
H As C CHCl + HC SH H2C OH
H SH H2C S As C CHCl + HC S E SH H2C OH
失活的酶
BAL
巯基酶 BAL与砷剂结合物
三、酶的抑制作用
（五）一些重要的抑制剂
*竟争性抑制举例
1.丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制
琥珀酸
琥珀酸脱氢酶 FAD FADH2
延胡索酸
COOH CH2 C H2 COOH 琥珀酸
COOH CH2 COOH 丙二酸
•
磺胺类药物的抑菌机制
与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶
二氢蝶呤啶 ＋ 对氨基苯甲酸 ＋ 谷氨酸
二氢叶酸 合成酶 二氢叶酸
H2N
加入非竞争性抑制 剂后，Km 不变，而 Vmax减小。
非竞争性抑制作用的Lineweaver–Burk图 ：
加入非竞争性抑制剂 后，Km 不变，而 Vmax减小。
非竞争性抑制剂与酶活 性中心以外的基团结合。 这类抑制作用不会因提高 底物浓度而减弱
三、酶的抑制作用
(二) 抑制作用的类型
（3）反竞争性抑制
影响因素包括有
底物浓度、pH、温度、 抑制剂、激活剂、酶浓度等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
影响酶促反应速率的因素：
底物浓度[S] 酶浓度[E] 反应温度 pH 值 抑制剂I 激活剂A
二、底物浓度对酶反应速度的影响
355
当底物浓度达到一定值 反应速度达到最大值 （Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加
10章酶反应动力学教学用
ES的生成速度：K1([Et] - [ES])[S] ES的分解速度：K-1[ES] K1([Et] - [ES])[S] = K-1[ES]
v 0 K cat [ ES ] K cat [ E t ][ S ]
[ES]K2[EK t]1S[][S]K [Etm ][S[S]] K1
Km K2K1 K1
Vmax=kcat [Et]
v 0 K 2 [ ES ] k cat [ ES ] K cat [ E t ][ S ]
Km [ S ] V max [ S ]
K m [S ]
Km 比Ks 更具普遍性。稳态下，当 K2<<K-1时，则Km= K-1/K1 =Ks ， 因 此平衡态可以看成是稳态的一个特例
⑤ 判断某一代谢反应的方向和途径
2. Kcat 的意义：催化常数或转换数
ES K K -11ES K K -22EP
K2 限速步骤速率常数
ES KK-11ES K2EP K3EP
K3 限速步骤限速常数
需要提出一个更通用 的速率常数，催化常
数，Kcat，用来描述任
一酶促反应在饱和时 的限制速率
因此:
kcat KM
k2 k2 /k1
k1
k1存在一个上限，取决于酶与底物在水溶液中的碰撞频率。如果每 次碰撞都能形成ES复合体，则根据扩散理论预言，k1将约为108 － 109mol-1·s-1·L，这是扩散控制的极限范围。酶的催化效率不能超过
此极限范围。
(四) 米一曼氏方程的线性化作图求KM和Vmax值
V max 2
米-曼氐方程线性化: 最常见的变换形式是Lineweaver-Butk方程
双底物酶促反应动力学机理
Km
K2 K3 K1
K2 K1
K3 K1
Ks
K3 K1
Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解 离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确 表示酶与底物的亲和力大小。
只有当K1 、 K2>>K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲 和力的大小。
E+P E + SP
- dES dt
=
k2 ES
+ k3 ES
当进入稳态时:
d ES dt
=
-
d ES dt
即: k1 E S = k2 ES + k3 ES = ES k2 + k3
稳态理论下米氏方程的推导
又由酶的恒等式: E0 = E + ES
E = E0 - ES
- 则: k1 E0 ES S = ES k2 + k3
E+S
k1 ES k3 E + P
k2
k4
布氏提出以下假设: 1.反应开始时, P = 0 ,不足已产生逆反应.测定酶的反应速度
一般是测定反应的初速度,即产物浓度变化在5%以内的速度.
2. E
S0 即反应中 S =. S0
3.反应开始后,反应立刻进入恒态状态, ES 浓度处于稳定状态 ES 的形成速度等于其分解速度.
三、米氏方程的讨论
Km与天然底物 Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为： Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S] 越灵
敏。
V
1/2Vmax
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ES 的生成量与消失量相等， 故平衡时 [ES] 浓度成一稳定状态。
Steady State 时 ES 的浓度恒定
S
P
浓 度
ES E
反应时间
Juang RH (2004) BCbasics
稳态理论(Steady State theory)的假设
Briggs的酶促反应模型:
E+S
k1 ES k3 E + P
k2
k4
布氏提出以下假设: 1.反应开始时, P = 0 ,不足已产生逆反应.测定酶的反应速度
一般是测定反应的初速度,即产物浓度变化在5%以内的速度.
2. E
S0 即反应中 S =. S0
3.反应开始后,反应立刻进入恒态状态, ES 浓度处于稳定状态 ES 的形成速度等于其分解速度.
E S K K12 ES K3 P E
V V max*[S ] Ks [S]
Ks为底物解离常数（底物常数）
Ks k2 ([E] [ES ]) [S]
k1
[ES ]
米式方程的导出： 早年的米式方程基于快速平衡假说
E S K K 21 ES K K 34 P E ① 在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。 ② 因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E ES可以忽略不记。
2
4
6
8
响
)
底物浓度 mmole
（单底物酶促反应）
Juang RH (2004) BCbasics
酶的底物饱合现象——中间络合物学说
酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间 产物进一步分解成产物和游离的酶。
酶催化剂 E S K K 12 ES K3 P E
非酶催化剂
当[S]=Km时
V V max[S] V max Km [S] 2
米氏方程定量的表达了反应初速度与底物浓度之间的关系 与实验结果相符合。
三、米氏方程的讨论
2、米式方程中各参数的意义 1) Km的意义
①物理意义: 当反应速度达到最大反应速度（Vmax)的一半 时的底物浓度.
②Km的引伸意义:Km是酶学研究中的重要研究数据,表示了 酶的一个基本性质.
稳态理论下米氏方程的推导
酶必须先与底物结合
E+S
k1 k2
ES
k3
(vo)
E+P
Steady State [ES] 浓度恒定
ES 的生成量 等于其消失量
k1[E][S] = k2 [ES] + k3 [ES]
由上式出发可推得 Michaelis-Menten 公式
vo=
Vmax Km +
[S] [S]
[E0] = [E] + [ES] vo = k3 [ES] Vmax = k3 [E0]
[E0] 酶的总量
Juang RH (2004) BCbasics
稳态理论下米氏方程的推导
E+
S
k1 k2
ES
k3
(vo)
E+P
推导:
ES 的生成速度: dES = k1 E S dt
ES 的分解速度: 包括正向: ES k3 负向: ES k2
整理:
- E0 S
ES
S
=
k2 + k3 k1
ES
- 令:
k2 + k3 k1
=
km
则: E0 S
ES S = km ES
E0 S = ES km + S
ES = E0 S km + S
[E0] = [E] + [ES] vo = k3 [ES] Vmax = k3 [E0]
[E0] 酶的总量
v = k3
KS现在称为底物常数
1925年Briggs和Haldane提出稳态理论
米氏推导酶促反应速度公式时，认为[ES]的积累是快速 平衡的结果，而没有考虑ESE+P这一步。而Briggs认为应 当考虑这一步，因为并不总是K3<<K2, ESE+P这一步也可 能速度很快，这时，E，S和ES将不能处于一个平衡状态。布 氏提出稳态理论。
第四节 酶促反应动力学（一）
一、底物浓度对酶反应速度的影响 二、米氏公式的导出 三、米氏方程的讨论 四、米氏常数的求法 五、多底物的酶促反应动力学
一
、S
012345678
底
+
物
E
浓 度
(
固 定
↓
80
对 酶 促
酶 的 浓 度
P
生
60
反在
成 40
应 速
固 定 时
度间
物 浓 20 度
的 影
内 反 应
0
0
ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S] ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S] = K2[ES]
[ES ] K 1[E][ S ] K 2 K 1[S ]
反应速度： V K3 [ES]
K3 [E][S] K2 [S] K1
Vmax [S] KS [S]
ES
=
k3
E0 km +
S S
因: Vmax=k3 E0
故:
v=
Vmax S km + S
三、米氏方程的讨论
1. 米氏方程的意义
当[S]<<Km时
V V max[S] V max[S] K’[S] Km [S] Km
当[S]>>Km时
V V max[S] V max[S] V max Km [S] [S]
E+P E + SP
- dES dt
=
k2 ES
+ k3 ES
当进入稳态时:
d ES dt
=
-
d ES dt
即: k1 E S = k2 ES + k3 ES = ES k2 + k3
稳态理论下米氏方程的推导
又由酶的恒等式: E0 = E + ES
E = E0 - ES
- 则: k1 E0 ES S = ES k2 + k3
E S K K 12 ES K3 P E
③ 游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形 成产物的速度极慢，故， [ES] 的动态平衡与ES P+E没有关系
（既 K1、K2 ＞＞K3 ） NhomakorabeaE S K K 12 ES K3 P E
E
SP
中间产物假说证据
Michaelis 与 Menten 提出酶催化动力学
Michaelis
1913年
Menten
Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.258
二、米氏方程的导出
1、根据酶反应的中间复合物学说： 假定E+SES迅速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度下， K3<<K2即K3反应特别慢，可以忽略不计。