嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探

取实验菌 BG05 发酵 4d 的培养液，一部分经 0.22μm 微 孔滤膜过滤除菌后 55℃，150r/min 继续发酵 2d，另一部分经 高温灭菌灭酶(121℃，20min)后 55℃，150r/min 继续发酵 2d。 以正常发酵 6d 的作为对照，进行感官评价，发酵液中的游离 氨基酸含量的测定按参考文献[2]，考察除菌灭酶对美拉德反应 的影响。 1.2.3 外界条件对美拉德反应的影响因素
56
其 OD 值达到 0.222，因此可以判断在这段时间内发生了一定 程度的美拉德反应，最终生成类黑精（Melanoidin），类黑精是 引起食品非酶褐变的主要物质[5]，其美拉德反应产物的增多导 致 OD 值增大。而 CK 随着时间的推移其吸光度只有很小幅 度的上升，可能是 50℃高温培养环境下产生了一定程度的褐 变，其曲线基本上是一条平行于 X 轴的直线。因此，可以初步 判断 BG05 对美拉德反应有一定的促进作用。
出，除菌液（过滤掉菌体）和灭酶液（将酶灭活）的培养基气味
与 CK 相比均有较大差别，特别是除菌液香味明显，灭酶液则
略带甜味，而对照 CK 则是原料味，因此我们认为经过除菌灭
酶处理，培养液必定发生了某种变化，从而造成除菌液香味优
于灭酶液这样的结果。
25000
氨基酸含量 /mg·L-1
20000
15000
液比 1:0.7、接种量 10%的外界条件能够更好的促进美拉德反应的进行，Fe3+ 对美拉德反应的发生有较明显的
促进作用。
关键词：嗜热芽孢杆菌；美拉德反应；促进；影响因素
中图分类号：Q 93.3;T S201.2
文献标识码：A
Study on Maillard Reaction by a Strain of Thermophilic Bacillus
CAO Jing- hua1, FANG Shang- ling1，CHEN Mao- bin1,ZHANG Ming- chun2,XIANG Wei2
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering (Ministry of Education), College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan Hubei 430068, China;2. HubeiBaiyunbian Co.Ltd. , Songzi, Hubei 434200, China)
从图 3B 可以看出，不同温度条件下发酵物的游离氨基 酸含量差别不大，55℃下为最高。美拉德反应与温度关系密 切，其反应速度随温度升高而加快，因此高温是促进美拉德反 应的一个重要环境因素。 2.3.2 发酵时间
●
15
B
10
5
0 35℃
●
●
●
45℃ 35℃- 55℃ 55℃ 温度 /℃
图 3 不同温度下的褐变度（A）及游离氨基酸含量（B）
在 35℃、45℃、35→55℃（35、45、55 各 2d）和 55℃条件下 实验菌 BG05 的褐变度及游离氨基酸含量变化见图 3。由图 3A 可知，随着温度的升高，褐变度逐渐增加，55℃条件下褐变 度明显高于 35℃和 45℃。
美拉德反应（Maillard Reaction）是氨基化合物和还原糖 生物尤其是嗜热菌的发酵及其代谢的酶类影响着美拉德反应 化合物之间发生的反应，它是法国著名科学家 L.C.Maillard 的发生，最终带给白云边酒特有的风格。为研究白酒酿造中微 于 1912 年发现的，广泛存在于食品加工和食品长期贮藏过程 生物在美拉德反应中起着何种作用及与风味物质的形成有何 中，是食品香味产生的主要来源之一[1]。中国白酒传统酿造工 关系，本实验从高温大曲中筛选到一株嗜热芽孢杆菌 BG05， 艺是为美拉德反应提供相应条件的经典之作，例如大曲培养 通过研究其与美拉德反应之间的关系，为今后进一步研究白
第六期
曹敬华，等：嗜热芽孢杆菌对美拉德反应的作用初探
2010
德反应的发生。 2.3 外界条件对 BG05 促进美拉德反应的影响因素 2.3.1 发酵温度
OD 值
0.6
0.5
0.4
0.3
A
0.2
0.1 ●
0
35℃
● ●
●
45℃
35℃- 55℃ 55℃ 温度 /℃
游离氨基酸含量 mg/100g
25
20
10000
5000
0 CK
除菌液 样品
灭酶液
图 2 发酵液游离氨基酸含量
菌株在 55℃下高温发酵，细胞分泌出的蛋白酶水解培养 体系中的蛋白质，为酱香物质的形成提供游离氨基酸。通过测 定发酵液中游离氨基酸含量，结果见图 2。除菌液中氨基酸含 量最高，其值达到 21320mg/L，灭酶液中游离氨基酸含量为 12140mg/L，除菌液和灭酶液的游离氨基酸含量均高于 CK，游 离氨基酸含量测定结果与感官评价结果比较一致，验证了前 面提到的发酵液经除菌灭酶处理后发生了某种变化这一论 断，香味浓郁的除菌液中游离氨基酸含量高于灭酶液和 CK。 因此可以说，除菌液和灭酶液均有一定程度的美拉德反应发 生，而除菌液的游离氨基酸含量高于灭酶液这一现象说明，将 发酵液的菌体过滤之后，发酵液中余下的某种酶促进了美拉
云边酒典型风味物质提供一定的基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株
嗜热芽孢杆菌 BG05，实验室保藏。 1.1.2 培养基
LB 培养基：蛋白胨 1%，NaCl 1%，酵母浸膏 0.5%，蒸馏 水 100mL，pH7.5，121℃灭菌 20min；
牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g， 琼脂 20g，自来水 1000mL，pH7.2~7.4，121℃灭菌 20min；
需要高温、微氧、高湿等环境以及酱香和浓酱兼香白酒酿造过 程中的高温堆积工艺，均为美拉德反应提供了相应条件，因而 美拉德反应与中国白酒的酿造生产密切相关，美拉德反应的 产物能为白酒带来香气突出、酒体醇厚、口味细腻、留香持久 等特点。在白云边独特的浓酱兼香型白酒生产过程中，多种微
* 基金项目：湖北省自然科学基金项目（2008CDB063）和湖北工业大 学博士启动基金（BSQ D0910）。 收稿日期：2010- 08- 04 作者简介：曹敬华（1986－），男，湖北天门人，硕士研究生，研究方向： 工业微生物。 ** 通讯作者：陈茂彬，博士，教授
用 250mL 三角瓶装 80mL 美拉德模式反应培养基，将实 验菌 BG05 以 5%的接种量接种到美拉德模式反应培养基中， 以未接菌的培养基为 CK。按照 30℃、40℃、50℃连续升温培 养（培养箱转速为 150r/min），前 2 个温度梯度下各培养 24h， 培养温度提高到 50℃时，以未接菌的空白培养基为对照，每 8h 测定 420nm 下的吸光值。以时间为横坐标，OD 值为纵坐 标，绘制标准曲线，研究 BG05 催化美拉德反应产褐变的能 力。 1.2.2 除菌灭酶
以麸皮固体培养基为基础，分别设置不同的温度、发酵时 间、初始 pH、料液比、接种量和金属离子进行发酵，最后测定 发酵物的褐变度及游离氨基酸含量。 1.2.4 褐变度测定[3]
每瓶发酵完成后的曲料中加入无水乙醇共 30mL，分两次 浸提曲料，共浸提 2h 后过滤去渣。取粗浸提液用酒精测乙醇 含量，添加适量蒸馏水，使乙醇含量为 60%之后，5000r/min 离 心 10min，弃去沉淀物，取上清浸提液比色测定。本试验以曲 料乙醇浸提液在 490nm 波长处的光密度值作为曲料的褐变 度。 1.2.5 游离氨基酸的测定
按参考文献[4]，用茚三酮显色法测量。 2 结果与分析 2.1 美拉德模式反应
从图 1 可以看出，经 30℃和 40℃培养 2d 后，实验菌 BG05 和未接菌的 CK 的 OD 值仅为 0.05 左右。进入 50℃培 养后，随着时间的推移，BG05 的吸光度逐渐的增加。从接种开 始培养至 25h 左右为一个诱发期，在此阶段 OD 值缓慢的上 升。25h 之后 OD 值随培养时间的延长迅速增加，培养至 88h
OD 值
0.25
0.2 ◆
◆
0.15
◆
◆ CK
◆
0.1
0.05◆ ■
◆ ■
◆ ■
◆ ■
◆◆ ■■
◆ ■
◆ ■
■ BG05
■ ■■■
0
0
20
40
60
80
100
时间 /h
图 1 BG05 和枯草芽孢杆菌的美拉德模式反应比较 2.2 除菌灭酶
表 1 感官评价结果
CK
除菌液
灭酶液
原料麸皮味
香味浓郁
略带甜味
除菌灭酶实验中各样品的感官评价结果见表 1，可以看
55
第六期
酿
酒
2010
美拉德模式反应培养基：甘氨酸 0.5%，NaCl 0.3%，葡萄 糖 1%，蒸馏水 100mL，pH 6.5，115℃灭菌 30min；
麸皮固体培养基（发酵培养基）：麸皮 9.9g，葡萄糖 0.1g， 加水 7mL，搅拌均匀后，115℃灭菌 30min；
麸皮浸出汁的制备：小麦麸皮 100g，高温淀粉酶 1500 I- U，加水 500mL，于 100℃蒸煮 10min。待冷却后，加入碱性蛋 白酶 50000IU，于 55℃保持 30min。过滤取上清液，pH6.2。 121℃灭菌 20min，使用前加葡萄糖至终浓度为 10g/L。 1.2 方法 1.2.1 美拉德模式反应
摘 要: 从白云边高温大曲中筛选到一株嗜热芽孢杆菌 BG05，通过美拉德模式反应和除菌灭酶实验发现，
BG05 对美拉德反应有一定的促进作用，存在某种酶能够催化美拉德反应的进行。以麸皮为固体发酵培养基，
研究外界条件对 BG05 促进美拉德反应的影响因素，结果表明：55℃高温发酵、8d 的发酵时间、初始 pH7.0、料