大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定
细菌人工染色体基因组文库的构建及应用
ｄｉ Ｏ３６ ０ｉ ｎ１０— ５６２ １．１ １ ｏ： ． ９ ．ｓ． ８ ７ １． ００ ． ２ ｌ ９ ｓ ０ ０ ０细菌人工染 色体基 因组 的构 建及应用 任 斐
（ 南科 技 学 院 ， 南 新 乡 ４ ３ ０ ） 河 河 ５ ０ ３ 摘要： 细菌人工染色体 （Ａ ） Ｂ ｃ 载体由于稳定复制 、 嵌合体少 、 分离纯化简单、 转化效率高等优点 在 构 建 基 因组
ｇ ｎ ｍ ｉ ｉ ｒ ｒ ｅ ｏ ｃ ｌｂ ａ ｙ
Ｒｅ ｅ ｎＦ ｉ
（ ｅａ Ｉｓｔｔ ｏ ｃｅｃ ａ ｄＴ ｃ ｎｌｇ， ｉｘａｇ４ ３ ０ ， ｈｎ ） Ｈ ｎ ｎ ｎｔｕｅ ｆ ｉ ｅ ｎ ｅｈ ｏ ｙＸ ｎ ｉ ５ ０ ３Ｃ ｉａ ｉ Ｓ ｎ ｏ ｎ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ａ ｔｒ ｌ ｔ ｃａ ｈ ）ｌｓＨｅ （ ＡＣ）ｅ ｔｒ ｒ ｒａ ｌ ｓｄｉ ｅ ｏ ｃｌ ｒｒ ｃｎ ｔｕ ｔ ｎ ｂ ｃ ｕ ｅ ｓｒ ｃ ：Ｂ ｃｅｉ ｉ ｉｌ ￣ｎｏｏ ｌ Ｂ ａ Ａｒ ￣ ｃ ｖ ｃｏｓａｅｂｏ ｄｙｕ ｅ ｎｇ ｎ ｍｉ ｉ ａｙ ｏ ｓｒｃｉ ｅ ａ ｓ ｂ ＂ ｏ
关 键 词 ：Ａ Ｂ Ｃ载体 ； 因组 ； 基 图位克隆 ； 物理图谱
中图分类号 ： ３３ Ｑ４． １
文献标识 码 ： Ａ
文章 编号 ：０８７ １（ １ ）１０４—５ １０—５６２ ００—０４０ ０
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ａ ｐｐ ｉａ ｉ ｎ ｏ ａ ｔ ｒａ ｒ ｉ ｃａ ｈｒ ｍ ｏ ｏ ｅ ｎｓｒ ｃ ｉｎ ｎｄ ａ ｌｃ ｔｏ ｆｂ ｃ ｅ ｉ ｌａ ｔｆ ｉ ｌｃ ｏ ｉ ｓｍ
Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ：ＢＡＣ ｖ ｃｏ ，ｅ ｏ ｃｌ ｒｒ ， ｐ ｂ ｓｄ ｃｏ ｉｇ，ｈ ｓｃ ｌ ｐ ｅｔｒｇ ｎ ｍｉ ｉ ａｙ ｍａ — ａｅ ｌｎｎ ｐ ｙ ｉａ ｂ ｍａ
大白菜GH3基因家族全基因组鉴定及表达分析
第45卷第4期2022年7月河北农业大学学报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITY Vol.45 No.4 J ul.2022收稿日期：2022-03-10基金项目： 国家自然科学基金（32172589）；河北省人力资源和社会保障厅项目（C20200329）；河北省科学技术厅项目（216Z2904G）；河北省教育厅项目（BJ2019020）.第一作者：李敬蕊（1979-），女，河北衡水人，副教授，研究方向为蔬菜逆境生理及分子生物学.E-mail:***************.cn 通信作者： 赵建军（1971—），男，河北沧州人，研究员，研究方向为蔬菜分子染色体工程、蔬菜种质资源评价与利用创新.E-mail:******************本刊网址：文章编号：1000-1573(2022)04-0015-10DOI ：10.13320/ki.jauh.2022.0055大白菜GH3基因家族全基因组鉴定及表达分析李敬蕊，解紫薇，卢 银，李 娜，刘紫俊，赵建军（河北农业大学 园艺学院/省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室/河北省蔬菜产业协同创新中心,河北 保定 071000)摘要：生长素酰胺合成酶（GH3）基因家族是生长素早期应答基因家族之一，在植物生长素信号转导过程中发挥重要作用。
基于大白菜全基因组数据对大白菜GH3家族进行全基因组鉴定及生物信息学分析，结果表明，在大白菜基因组中共鉴定到45个包含GH3结构域的BrGH3家族成员；BrGH3家族成员编码氨基酸数在286～826之间，分子量介于32.06～90.77 KD 之间；系统进化分析将BrGH3家族分为4类；基因结构分析发现该家族成员外显子数为2～10个；蛋白保守基序（motif ）分析表明，除了BrGH3.2和BrGH3.18外，BrGH 3家族成员都含有10个Motif ；41个BrGH3成员在10条染色体上均有分布，4个基因未定位到染色体上；共线性分析发现29个基因参与片段复制事件，存在5个串联重复；启动子顺式作用元件分析表明，BrGH3成员含有大量光、激素、逆境和生长发育等响应元件。
BAC文库的构建
BAC文库构建技巧基因组DNA文库构建实验技巧基因组DNA文库有十分广泛的用途，如用于分析、分离特定的基因片段，用以基因表达调控、人类及动植物基因组工程的研究。
通常情况下，基因组文库构建的基本流程可以归为4大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞。
一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。
研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA 分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。
二、处理基因组DNA根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。
不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
比如，对于黏粒载体（比如Epicntre的pCC1FOSTM、pEpiFOSTM-5、pWEB-TNCTM、pWEBTM），合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体（比如Epicentre 的pIndigoBAC-5、pCC1BACTM），平均来说，合适的片段长度为120kb-300kb。
构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA 连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb 左右的DNA片段，随后使用Epicentre GELase 胶回收试剂盒回收DNA。
构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。
需要注意：（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
用Epicentre试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。
大白菜、结球甘蓝、黑芥同源多倍体新种质的创建
大白菜、结球甘蓝、黑芥同源多倍体新种质的创建人工诱导多倍体是创建新种质和新材料的重要途径之一，它可以直接应用于新品种的选育，同时作为桥梁亲本可以克服远缘杂交不亲和性，打破种间杂交不育的瓶颈、实现作物育种的突破。
本文采用秋水仙素药液滴蘸籽苗生长点、细胞DNA含量检测、染色体数目鉴定及核型分析等方法对大白菜、结球甘蓝和黑芥等芸薹属植物进行了多倍体诱变和鉴定，并对获得的多倍体进行了形态学、细胞学、营养品质和分子水平甲基化研究。
主要结果如下：1.通过优化秋水仙素处理方法，成功获得了大白菜、结球甘蓝和黑芥的同源四倍体和同源八倍体新材料，使大白菜、结球甘蓝和黑芥的加倍体株率均达到80%以上。
2.大白菜、结球甘蓝和黑芥四倍体植株的染色体数分别为2n=4x=40、2n=4x=36和2n=4x=32，各有4个染色体组，通过流式细胞仪分析，结果显示四倍体植株的细胞DNA含量分别是其二倍体亲本的2倍。
3.大白菜、结球甘蓝和黑芥四倍体的减数分裂行为均比较正常，花粉生活力在70.85%-82.35%；八倍体的减数分裂极为紊乱，不能形成正常的花粉。
4.大白菜、结球甘蓝和黑芥四倍体生长旺盛，可溶性糖、Vc、粗蛋白和水分等营养品质的含量均高于其二倍体亲本。
5.对大白菜、结球甘蓝和黑芥的二倍体亲本与其相应的四倍体植株DNA甲基化水平及其模式进行了分析，结果表明：四倍体DNA总甲基化率有所增加。
大白菜、结球甘蓝和黑芥的二、四倍体甲基化水平与模式有显著区别，这些变化可能会控制某些基因的表达，从而在表观遗传等方面体现出来。
白菜转基因实验报告
一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。
白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。
本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。
- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。
- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。
- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。
2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。
1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。
1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。
1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。
1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。
2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。
3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。
3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。
三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。
2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。
3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。
大白菜WRKY转录因子的全基因组鉴定与分析
ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｖ ａ ｙｉ ｒ ｎ ｇ ｆ ｒ ｏ ｍ １ ４ ３ ｔ ｏ １ ０ ８ ２．Ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｆ ｕ ｌ ｌ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｇ ｅ ｎ ｏ ｍｉ ｃ Ｄ ＮＡ ｗｅ ｒ ｅ ８ ８ ０ ｔ ｏ ９ ０ ９ ９
摘
要 ：ＷＲ Ｋ Ｙ转 录因子是一类重要 的调控分子 ， 在高 等植 物 中以基 因家族的形式存在 。试 验 以大 白菜基
因组数据为材料 ， 利用生物信息学手段对 ＷＲ Ｋ Ｙ转录因子进行了全基 因组 鉴定 与分析 。结果表 明， 大 白菜 至 少有 １ ３ ４个 ＷＲ Ｋ Ｙ转录因子 ， 蛋 白序列长度为 １ ４ ３～１ ０ ８ ２ ； 基因组 Ｄ Ｎ Ａ全长 ８ ８ ０— ９ ０ ９ ９ ｂ ｐ ， 具 １ ～１ ５个 内含 子 。染 色体定位结果表 明 ， １ ０条染 色体上 均有 ＷＲ Ｋ Ｙ转 录因子基 因的分布 ， Ａ ３染色体 上最多 （ ２ ６ ） ， Ａ１ ０染 色体分 布最 少（ ４ ） 。大 白菜 ＷＲ Ｋ Ｙ转录 因子可分为 ３大类 ， Ｉ 类、 Ⅱ类 和 Ⅲ类 的数 量分别 为 ２ ７ ， ８ ３和 ２ ４ ， 它 们处 于 进化 树 的不 同 分支 。除保 守 的 ＷＲ Ｋ Ｙ Ｇ Ｑ Ｋ 和 常见 变 异 序列 ＷＲ Ｋ Ｙ Ｇ Ｋ Ｋ外， 新 发 现 ＷＲ Ｋ Ｄ Ｇ Ｑ Ｋ， ＷＲ Ｋ Ｎ Ｇ Ｑ Ｋ和 ＷＭＫ Ｙ Ｇ Ｑ Ｋ等 ３ 种 ＷＲ Ｋ Ｙ结构域类型 。 关键词 ： 大 白菜 ； ＷＲ Ｋ Ｙ转录因子 ； 全基 因组 ；序列 分析
Ｊ Ｉ ＡＮＧ Ｍｉ ｎ ｇ ，ＭＩ ＡＯ Ｌ ｉ — ｘ ｉ ａ ｎ ｇ ，Ｚ ＨＡＮＧ Ｙｙ ｕ — ｃ ｈ ａ ｏ ，ＧＵ ＡＮ Ｍｉ ｎ ｇ ，Ｐ Ａ Ｎ Ｘｉ ａ ｏ — ｃ ｕ ｉ
大白菜_em_hau_em_胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析
园艺学报 2012，39（3）：469–476 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@大白菜hau胞质雄性不育系的鉴定及不育相关基因结构分析施展，万正杰*，徐跃进，李雪红，邹瑞昌（华中农业大学园艺林学学院，华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）摘 要：采用染色体压片法和形态观察法，对大白菜hau胞质雄性不育材料6w-9605A的2个遗传世代（F1和BC6）的染色体数和花器官进行鉴定。
结果表明：F1染色体数为28条；BC6染色体数为20条，与白菜的染色体数相同。
6w-9605A的花药呈三角形，干瘪无花粉，败育彻底。
利用芸薹属作物雄性不育基因线粒体保守序列设计3对引物，在6w-9605A中扩增出867 bp的片段。
基因预测显示，在线粒体基因atp6的下游产生1个新的开放阅读框为orf288，与目前报道的芸薹属作物细胞质雄性不育相关基因orf224、orf138等均不相同，这种新的基因结构特点极有可能就是大白菜hau胞质不育系6w-9605A产生不育的原因。
关键词：大白菜；雄性不育；hau胞质；不育基因中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）03-0469-08 Characterization of the Chinese Cabbage hau Cytoplasmic Male-sterile Line and Sequence Analysis of the Fertility-related GeneSHI Zhan，WAN Zheng-jie*，XU Yue-jin，LI Xue-hong，and ZOU Rui-chang（College of Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Education Ministry Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）Abstract：The male-sterility of the Chinese cabbage（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）line 6w-9605A，a cytoplasmic male-sterile line，was studied in this research. Chromosome squashing revealed that the chromosome numbers in the F1 and BC6 of 6w-9605A were 28 and 20，respectively，and morphologic observation in the BC6 of 6w-9605A showed that the anthers of this line were degenerated and completely abortive. Further，primers were designed based on the conserved sequence of known cytoplasmic male sterility genes in the Brassica species，and a new open reading frame（ORF）of 867 base pairs was amplified from 6w-9605A. Sequence analysis showed that this ORF located downstream from the mitochondrial gene apt6 and was predicted as orf288. Sequence alignment demonstrated that the ORF is different from the sterile genes of pol CMS and ogu CMS，and it may cause the sterility of 6w-9605A.Key words：Chinese cabbage；male-sterility；hau cytoplasm male-sterile line；infertility genes收稿日期：2011–12–19；修回日期：2012–02–21基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（2009QC027）；湖北省自然科学基金项目（2010CBB01703）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：wanzj@）致谢：本文得到华中农业大学植物科学学院李再云教授的修改，在此表示感谢。
大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析
大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析大白菜VQ基因家族鉴定及功能分析摘要：VQ基因家族是一类参与植物激素信号传导和逆境响应的重要基因家族。
本研究旨在通过生物信息学和功能分析探究大白菜（Brassica rapa）中VQ基因家族的特征和功能。
通过鉴定和分析VQ基因家族，可以深入了解大白菜的激素信号传导和逆境响应机制。
一、引言大白菜是我国重要的经济作物之一，具有重要的食用和营养价值。
随着植物基因组学和生物信息学的发展，越来越多的研究发现大白菜中参与植物生长发育和逆境响应的基因家族。
VQ基因家族是其中一个重要的基因家族，目前关于大白菜中VQ基因家族的研究报道较少。
二、材料与方法1. 数据收集：从公共数据库中下载大白菜基因组序列和已知的VQ基因序列。
2. 生物信息学分析：利用BioPerl和BLAST软件进行序列比对和分析，得到大白菜中VQ基因家族的序列特征和进化关系。
3. 表达模式分析：通过大白菜基因表达数据库和实时定量PCR技术，研究VQ基因家族在不同发育阶段和逆境处理中的表达模式。
4. 功能分析：利用基因转化技术，研究VQ基因家族参与植物生长发育和逆境响应的功能。
三、结果与讨论1. VQ基因家族的特征：通过生物信息学分析，发现大白菜基因组中有多个VQ基因家族成员，具有VQ保守序列和TIFY结构域。
2. 进化关系分析：VQ基因家族成员在进化上分为了不同的亚家族，并与拟南芥中的VQ基因家族有一定的相似性。
3. 表达模式分析：在大白菜生长发育过程中，部分VQ基因家族成员表达量在不同发育阶段变化明显。
在逆境处理中，一些VQ基因家族成员受到外界逆境的诱导，表达量显著上调。
4. 功能分析：转基因大白菜植株在生长发育和逆境响应方面表现出明显的差异。
部分VQ基因家族成员的过表达可以促进植株的生长发育，增强逆境抗性。
四、结论通过本研究对大白菜VQ基因家族进行鉴定和功能分析，揭示了其在植物生长发育和逆境响应中的重要作用。
细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术
细菌人工染色体文库基因组DNA制备技术陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【摘要】试验旨在对基因组DNA的制备进行研究,为细菌人工染色体(bacterial artificial charomosome,BAc)文库的构建奠定基础.以豁眼鹅全血为试验材料,提取高质量的基因组DNA,分别采用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和BamHⅠ3种限制性内切酶对所提基因组DNA进行部分酶切,并利用控制酶切时间、设置不同的Hind Ⅲ酶切浓度梯度对基因组DNA进行部分酶切.结果表明,Hind Ⅲ为最佳限制性内切酶,并得到了最佳酶切用量(40U/μL).该方法所制备的基因组DNA质量较好,可用于BAC 文库的构建.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)005【总页数】4页(P79-82)【关键词】细菌人工染色体;基因组DNA;限制性内切酶;酶切【作者】陈献伟;王会;关伟军;高剑峰【作者单位】石河子大学生命科学学院,石河子,832003;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193;石河子大学生命科学学院,石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q343.2基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞核DNA的大部分或全部片段随机连接到克隆载体上,再转移至适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段无性繁殖系的总集,是含有某种生物全部或大部分随机片段的重组DNA克隆群体,又称为人工构建的“基因银行”(gene bank)。
BAC文库的建立,为今后的基因组学的研究提供了一个强有力的技术平台(Zhang等,1996),也成为图位克隆基因(景润春等,2000)、基因组物理作图(Tao等,2001)、基因组测序(Cayanis等,1998)、基因组组织结构分析、一些特殊基因组序列(Alu,SSR)简单筛选及基因表达调控和基因转化等研究的重要资源。
细菌人工染色体技术研究进展
中圈 分 类 号 ： ８ ３ Ｑ １． ４
文献标识码： Ａ
文 章 顺 序 编号 ： ６ ２ ５ ９ （ Ｏ ８ ０ 一 ３ — ４ １７ — １０ ２Ｏ ）５ Ｏ ３ ０
隆 ， 少 用 于 Ｄ Ａ文 库 （ Ｎ ｂａｙ 的构 建 ， 很 Ｎ Ｄ Ａ ｌ ｒｒ） ｉ 尤
其 是 真 核 生 物 的 文 库 构 建 ； 黏 粒 容 量 虽 有 所 增 大
究 中都 有 着 广 泛 的 应 用 ，对 促 进 分 子 生 物 学 研 究
的迅速 发展起到 了重要作 用 但 随着研 究 的深 入 ， 以上 系统 也 逐 渐显 现 了它 们 的一 些 固有 缺 陷 ： 质
粒 系 统 容 量 小 （ ｌ ｈ ，只 适 用 于 一 般 基 因 的 克 ＜ ５ｋ ）
系 ， 在 含 Ｘ ｇｌＩＴ 的 平 板 上 生 长 ４ — ａ、 Ｇ Ｐ ８ｈ后 ， 出
现 １ ０％～ １ ４． ５％的 蓝 色 细胞 ； 同年 Ｂ ｋ ｒ 建 了 ａｅ 构
含 荧 光 素 酶 或 绿 色 荧 光 蛋 白 Ｇ Ｐ的 Ｂ Ｃ载 体 ， Ｆ Ａ
以 此 载 体 克 隆 ７ ～ ７ ｂ 的 人 类 基 因 组 Ｄ Ａ， ０ １０ ｋ Ｎ
繁琐局 限 了它 的使用 。能否建 立一种 容量大 ， 能够 稳定遗 传且 易于操 作 的载 体 系统 成 为众 多分 子生 物学工 作 者的愿 望 真核 基 因组 克 隆载 体 的特点 及其 比较见表 １ ： 细菌人 工 染 色 体 （ ａｔ ｉ ｒｆ ｉ ｈｏ — ｂｃｅ ａ ａ ｉｃａ ｃ ｒ ｒ ｌ ｔｉ ｌ ｍｏ
（ ５ ｂ ， 对于一 些较大 的基 因簇 （ｅ ｅ ｌｓ ｒ ＜４ ）但 ｋ ｇｎ ｕｔ ） ｃ ｅ 的研究 仍然无能 为力 ； Ａ Ｙ Ｃ系统 容量很 大 （ 至数 可 Ｍ ） ｂ ，已被广泛应 用于 Ｄ Ａ文 库的构 和基 因簇研 Ｎ
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园艺学报 2011，38（1）：151–158 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定冯大领1,2，石学萍1，杨 煜3，王彦华1，轩淑欣1，赵建军1，申书兴1,*（1河北农业大学园艺学院，河北保定 071001；2河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001；3山东省农业科学院高新技术研究中心，济南 250100）摘 要：以我国优良的大白菜自交系‘85-1’为材料，利用pIndigoBAC-5为载体，通过对高分子量DNA的制备、大片段DNA的选择、连接转化条件等几个方面的优化，构建了大白菜细菌人工染色体文库。
该文库由57 600个克隆组成，平均大小为98.4 kb，空载率为1.5%；覆盖大白菜基因组10.3倍；挑取6个克隆培养5 d后，经Hin dⅢ完全酶切检测，其指纹图谱稳定一致。
大白菜细菌人工染色体文库的构建为重要功能基因的克隆和定位及比较基因组研究奠定了基础。
关键词：大白菜；细菌人工染色体文库；插入片段；稳定性中图分类号：S 634.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）01-0151-08 Construction and Characterization of a Bacterial Artificial Chromosome Library from Chinese CabbageFENG Da-ling1,2，SHI Xue-ping1，YANG Yu3，WANG Yan-hua1，XUAN Shu-xin1，ZHAO Jian-jun1，and SHEN Shu-xing1,*（1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；3High-tech Research Center，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Ji’nan 250100，China）Abstract：A bacterial artificial chromosome library of Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour.）Olsson（Chinese cabbage）was constructed from inbred line‘85-1’with the vector pIndigoBAC-5. The key processes of the construction，such as preparation of high molecular weight DNA，selection of digested fragments，condition of ligation and transformation，were studied. The library consists of 57 600 clones in which the average insert size is about 98.4 kb and the empty clones are about 1.5%. The library represents an equivalent of 10.3 fold size of Chinese cabbage genome. Six clones randomly picked from this library show no Hin dⅢ fingerprint changes after 5 days’ successive culture，which indicates that the clones in the library are stable. The library will lay the foundation for gene clone，location and comparative genomics research of Brassica.Key words：Chinese cabbage；bacterial artificial chromosome library；insert fragment；stability收稿日期：2010–08–23；修回日期：2010–12–20基金项目：国家自然科学基金项目（30871713）；高等学校博士学科点专项科研基金（20101302110001）；河北省自然科学基金项目（C2010000738）；河北省应用基础研究计划重点基础研究项目（08965514D）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：shensx@）致谢：本试验得到了山东省农业科学院高新技术研究中心李广存博士以及河北农业大学王省芬教授、张娜博士的指导，在此表示感谢。
152 园艺学报38卷构建基因组文库是从DNA水平上对各种生物进行研究的技术平台，基因组文库是永久保存基因资源的最好方法，也是进行基因组结构和功能研究的基础。
细菌人工染色体文库（Bacterial artificial chromosome library，BAC文库）具有插入片段大、稳定性强、易于操作等优点，是应用最广泛的基因组文库。
目前已经在多种植物中成功构建，如拟南芥（Choi et al.，1995）、水稻（彭开蔓等，1998；Qiu et al.，1999；刘华清等，2003）、菜豆（Vanhouten & MacKenzie，1999）、小麦（Ma et al.，2000；Chen et al.，2002）、玉米（Zhang et al.，2000；Yang et al.，2003）、甘蓝（Vicente & King，2001；Gao et al.，2004）、棉花（王省芬等，2006）、油菜（陈书元等，2008）等。
BAC文库在基因的染色体物理定位、物理图谱构建、比较基因组研究、基因的图位克隆、基因组测序等方面发挥着重要作用。
大白菜[Brassica campestris L.ssp.pekinensis（Lour.）Olsson]是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）植物，是我国乃至世界重要的蔬菜作物。
自2003年成立多国芸薹属基因组计划以来，韩国和英国构建了白菜类作物A基因组的BAC文库（KBrH、KBrB、KBrS、JBr），并利用BAC克隆末端测序进行了一系列结构基因组方面的研究（http：//www. brassica. info；Bancroft，2006）。
Trick 等（2007）和Suwabe等（2008）利用BAC克隆末端测序进行了A基因组的序列分析及甘蓝型油菜与白菜基因组遗传连锁图谱的整合。
Park等（2005）和Hong等（2006）利用BAC克隆开展了大白菜与拟南芥的比较基因组研究。
Mun等（2008）建立了基于大白菜BAC克隆的第1张物理图谱。
河北农业大学园艺学院蔬菜育种实验室多年来一直从事大白菜细胞、分子遗传及育种工作，创建了大白菜整套初级三体以及结球甘蓝—大白菜异附加系等多种遗传材料（申书兴等，2006；张玉成，2008；顾爱侠等，2009；张巍巍等，2009）。
由于大白菜和结球甘蓝均属于小染色体作物，普通的核型分析方法很难将异附加系中结球甘蓝和大白菜的全部染色体分辨出来。
本研究中以具有我国特色的优良大白菜自交系为材料构建BAC文库，为利用BAC-FISH技术区分异附加系中外源染色体、定位和筛选优良的功能基因以及研究基因间互作与性状间的关系奠定基础。
1 材料与方法1.1材料供试材料为大白菜自交系‘85-1’，是包头品种类型的骨干亲本。
该自交系叶色浅绿、叶帮白，叶球圆形，生长期70 d左右，抗病性强，配合力高。
由河北农业大学园艺学院蔬菜育种实验室提供。
1.2主要试剂及仪器克隆载体采用Epicentre公司的pIndigoBAC-5（Hin dⅢ-cloning ready）；感受态细胞采用Invitrogen 公司的DH10B菌株；Hin dⅢ和T4连接酶购自NEB公司；精胺、亚精胺、蛋白酶K、氯霉素购自Sigma公司。
脉冲场电泳仪采用Bio-Rad CHEF-DRⅡ，电击转化仪采用Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ，冷冻离心机为Sigma公司的3-16 PK。
1.3 BAC文库构建方法1.3.1 高分子量基因组DNA的提取本提取方法按照Zhang等（1996）和Ma等（2000）方法并做改进。
取培养12 ~ 15 d的大白菜真叶30 g用液氮浸泡研磨成粉末，迅速放在300 mL预冷的核离析液中（内含0.1% β–巯基乙醇 + 10% Triton-100），15 min后用微细滤布（Microcloth）过滤到50 mL离心管中，4 ℃ 1 800× g离心10 min，加5 mL核离析液悬浮细胞核，合并各离心管的溶液，4 ℃ 1 800× g离心10 min，重复11期 冯大领等：大白菜细菌人工染色体文库的构建及鉴定 153次。
加入不含β–巯基乙醇和Triton-100的核离析液1 mL 。
42 ℃水浴3 min ，迅速加入等体积的1.5%低熔点琼脂糖（核离析液配制），轻轻混匀，加入胶块模具（Plug mold ）中，冰上30 min ，制备成胶块。
将胶块放入含1 mg · mL -1蛋白酶K 的裂解液中，50 ℃水浴摇床中22 h ，重复1次。
将胶块置于30 mL 含40 μg · mL -1苯甲基磺酰氟（PMSF ）的T 10E 10（10 mmol · L -1 Tris-HCl ，10 mmol · L -1 EDTA ）中冰上2 h ，重复1次。
再将胶块放在不含PMSF 的T 10E 10中1 h 清洗胶块，重复1次。
随后将胶块置于0.5 mol · L -1 EDTA 中4 ℃保存备用。
1.3.2 基因组DNA 的部分酶切及大片段DNA 的获得选择最佳酶切条件之前，首先对胶块进行预电泳，预电泳条件为：电压4 V · cm -1，起始脉冲5 s ，终止脉冲5 s ，脉冲时间4 h 。