人工染色体载体
鸭细菌人工染色体文库的构建及连锁群的FISH定位的开题报告
鸭细菌人工染色体文库的构建及连锁群的FISH定位的开题报告一、研究背景人工染色体（artificial chromosome，AC）是指在体外合成的、能够与真核细胞染色体相媲美的一个或多个染色体。
AC具有许多优点，如能够容纳大的外源DNA片段、稳定遗传和高效表达等。
由于AC的这些优点，目前在人类、动物和植物等领域均有广泛的应用。
鸭细菌是一种重要的饲料添加剂，在家禽和畜牧业中广泛使用。
但是鸭细菌对抗生素具有抗性，因此对鸭细菌的研究对于制定合适的饲养管理计划具有非常重要的意义。
二、研究目的本研究的主要目的是构建鸭细菌人工染色体文库，并利用FISH技术对连锁群进行定位，以期实现对鸭细菌的更深入研究。
三、研究内容和方法1.构建鸭细菌人工染色体文库本研究采用现代分子生物学技术，包括基因组DNA的提取、文库的构建、高通量测序和数据分析等步骤。
首先，利用列式法对鸭细菌进行基因组DNA提取，并使用限制酶将DNA片段进行切割。
然后，将DNA 片段连入人工染色体载体中，得到一个鸭细菌人工染色体文库。
最后，进行高通量测序和数据分析，鉴定所得序列。
2.连锁群的FISH定位首先，根据测序获得的序列信息设计合适的探针，并进行标记。
然后，准备与其亲缘关系较近的鸭细菌菌株作为目标，将探针引入目标细胞内，进行FISH技术的检测，定位目标序列及连锁群。
四、研究意义和预期结果本研究利用人工染色体技术构建了鸭细菌文库，并利用FISH技术对连锁群进行定位，实现对鸭细菌的深入研究。
预期结果包括：获得鸭细菌人工染色体文库，识别出鸭细菌基因组中的重要序列，为后续的生物学功能研究提供基础，并掌握FISH技术，为针对鸭细菌及其它细菌的基因定位研究提供基础设施。
微生物基因组学 ppt课件
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六、研究基因组功能的意义 1． 加速致病基因的研究 2． 寻找灵敏而特异性的病原分子标记 病原微生物的特异性DNA序列可以作为分子标记用于疾病的诊断。 3． 促进新药的发现和疫苗的发展 （1）促进新药的发现 （2）疫苗的研究 4． 促进微生物分类的发展
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5. 提高对人类相关基因功能的认识
（1）一些人类的遗传性疾病，如结肠癌、肝豆状核变性、肾上腺脑白质 营养不良等，在细菌的基因组分析中，也存在类似的蛋白物。
（2）可以利用微生物做模拟，去检测高等生物的基因性状和功能。 （3）从基因水平去揭发人类疾病与病原微生物之间关系，如发病机理， 人类与病原微生物之间相互作用的基因机理等。
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三．微生物基因组的注释 （一）概念：在微生物基因测序的基础上，对其基本 结构和部件进行认定，以进一步研究其功能。
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（二）微生物基因组注释的内容 1.碱基组成分析，即G+C Mol%测定。 G+C含量是物种的一个重要特征，在微生物的分类上具有重要意义，是 重要参数之一。 2．开放阅读框的鉴定： 3．编码序列分析
消化 （4）分子杂交 （5）Southern十字杂交法
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五、微生物基因组功能分析 1、根据目的基因组的性状而推测可能的基因组功能。 如致病岛的G+C mol%与细菌本身的G+C mol%有很大差异。致病岛或耐 药岛等。 2、根据已知的数据库进行同源性搜索。 美国NIH的GenBank；欧洲的分子生物学实验数据库（FMBL）日本的 DNA数据库(DDBJ) 3、利用不同条件、不同作用因素的影响而鉴定未知基因的功能。 如用过氧化氢酶处理沙门氏菌而获得该菌的对H2O2氧化应激反应的基因。 4、采用基因敲除的方法来推测或确定基因的功能。
2017-5-25 合成生物学
选择标记--Sup4
• Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成 为白色)。 • 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的 菌落呈白色。
• 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已 经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色 菌落。
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• 一般酵母表达载体都以大肠 杆菌质粒为基本骨架再加上
合成生物学(Synthetic biology)
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1.人工合成酵母染色体 2.人工合成酵母基因组
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酿酒酵母简介
• 酵母（Yeast）是一类种类繁多的生物资源，已知 有80个属约600多种，数千个分离株。
• 酵母是一类单细胞的真核生物。 – 它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达调 控机制。 – 它既能通过有丝分裂进行无性繁殖 – 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。
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Cre-LoxP重组酶系统
• • Cre-LoxP重组酶系统 – LoxP（locus of X-over P1）序列： Cre-LoxP 重组酶系统 • 来源于 P1噬菌体 – 如果两个 LoxP 位点分别位于两条不同的 DNA链或染色体上 • 有两个 13bp 反向重复序列和中间间隔的 8bp序列 ，Cre 酶能介导两条 DNA 链的交换或染色体易位。 共同组成， 8bp 的间隔序列同时也确定了 LoxP的 方向。 • 13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端 重复序列(TEL)，以保持重组 YAC为线状结构；
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⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以便 pYAC4在细菌细胞中稳定 扩增；
合成生物学
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YAC载体
首先用EcoRI和BamHI双 酶切割，获得均具 BamHI和EcoRI切割末端 的两个DNA片段(双臂) ，随后把两端具EcoRI 切割末端的外源DNA与 此双臂连接，构成酵母 人工染色体。用电激仪 把此人工染色体转化酵 母受体细胞。
Science Volume 355(6329):eaaf4704
March 10, 2017
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Synthetic Yeast 2.0
• Building the world‘s
first
synthetic
eukaryotic
genome
together！
Dr. Jef Boeke
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目录
synV设计原理 人工设计基因组原则 PCRTags 引入新序列 Cre-LoxP重组酶系统 组装
Cre-LoxP重组酶系统 Cre重组酶 于1981年从P1噬菌体中发现，基因编码区序列全长1029bp。 一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之 间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组
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Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统 – LoxP（locus of X-over P1）序列：
删除
逆转录转座子
换位
Elements
替换
将TAG替换为TAA
引入
不变
Gene order
端粒重复部分 内含子
tRNA基因 部分同义密码子替换 LoxP Sym sites
PCRTags
Noncoding regions
• 利用密码子简并性实现
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指能够携带外源DNA进入细胞并使其复制繁殖的分子，通常是一种圆形、线性或环形的DNA分子。
基因载体在基因工程和生物技术中扮演着非常重要的角色，可以被用于DNA序列的克隆、表达和传递等方面。
下面是一些常见的基因载体名词解释：1.质粒（Plasmid）质粒是一种环形DNA分子，通常存在于细菌和酵母等微生物细胞内。
质粒可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA序列来实现基因克隆和表达。
2.噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌细胞内的病毒，可以感染并复制繁殖在细菌细胞内。
噬菌体可以被用作基因工程的载体，通过插入外源DNA 序列来实现基因克隆和表达。
3.表达载体（Expression Vector）表达载体是一种专门用于外源基因表达的基因载体，通常包含有启动子、转录终止子、选择标记等功能元件，可以实现对外源基因的高效表达。
4.病毒载体（Viral Vector）病毒载体是一种基因载体，可以将外源基因导入宿主细胞中，并利用病毒的自身复制机制实现外源基因的表达。
病毒载体可以用于基因治疗、基因疫苗等方面。
5.贝壳素粒子（Shell Vial Particle）贝壳素粒子是一种基于病毒样颗粒（VLP）的基因载体，可以用于疫苗研究和制备。
贝壳素粒子在疫苗制备中具有很高的应用价值，可以实现对多种病原体的有效预防和控制。
6.人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是一种基因载体，可以模拟自然染色体的结构和功能，用于基因治疗、基因修复等方面。
人工染色体可以携带大量的外源DNA序列，并实现稳定的遗传转移和表达。
7.负载（Payload）负载是指基因载体中携带的外源DNA序列，通常包括了目标基因、选择标记、报告基因等。
负载的设计和选择对于基因工程的成功非常关键，需要考虑到载体的适应性、表达效率、稳定性等因素。
8.选择标记（Selection Marker）选择标记是指基因载体中用于筛选转化细胞的标记基因，通常包括了抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
5 第五讲 分子克隆载体
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合 成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。 非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
含四个部分：
MCS
lacZ`
Ampr Ori
（1）来自pBR322的质粒 复制起点（ori）； （2）ampr ;
（3）大肠杆菌β半乳糖苷酶
基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列；
（4）多克隆位点（MCS）
pUC18
pUC19
Insert
Lac Z`
Lac Z`
ampr
No insert
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。 含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。 将质粒pSF124中含ampr 基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr 基因的DNA片段同含ColE1复制起始点(来源于 pMB1 、 松 散 型 ) 的 DNA 片 段 重 组 ， 构 建 成 质 粒 克 隆 载 体 pBR322。
（2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌 素基因）；
（3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达40kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA的构建。部分柯斯质粒的基本特性
人工染色体载体
(artificial chromosome vector)
dna分子克隆技术名词解释
dna分子克隆技术名词解释篇一DNA 分子克隆技术那可真是个超厉害的生物技术手段哇。
先说说啥是载体吧。
载体就像是一辆小货车，专门负责把目的基因运送到宿主细胞里去。
没有载体，目的基因就很难进入宿主细胞发挥作用呢。
载体在DNA 分子克隆中起着至关重要的作用。
它就像是一个快递员，把重要的货物安全准确地送到目的地。
常见的载体类型有质粒和噬菌体。
质粒是一种环状的DNA 分子，它存在于细菌等微生物中。
质粒有很多优点呢。
它相对比较小，容易操作。
而且质粒可以在不同的细菌之间传递，这就为基因的转移提供了便利。
质粒还可以携带多个基因，这在一些复杂的基因工程实验中非常有用。
比如在构建基因文库的时候，就可以用质粒来携带大量的基因片段。
质粒适用于很多不同的宿主细胞，比如大肠杆菌等。
所以质粒在基因工程中被广泛应用。
噬菌体也是一种很重要的载体。
噬菌体是一种专门感染细菌的病毒。
噬菌体可以把自己的DNA 注入到细菌细胞中，然后利用细菌的代谢系统来复制自己。
在DNA 分子克隆中，噬菌体可以被改造用来携带目的基因。
噬菌体的优点是它可以携带比较大的目的基因片段。
而且噬菌体的感染效率很高，可以快速地把目的基因传递到宿主细胞中。
噬菌体适用于一些需要高效传递大基因片段的实验。
比如在构建基因组文库的时候，就可以用噬菌体来携带大片段的基因组DNA。
除了质粒和噬菌体，还有一些其他的载体类型，比如病毒载体和人工染色体等。
病毒载体可以感染各种不同的细胞，包括动物细胞和植物细胞。
病毒载体的优点是它可以高效地传递目的基因，而且可以在细胞内长期表达目的基因。
但是病毒载体也有一些缺点，比如它可能会引起免疫反应，而且病毒载体的构建比较复杂。
人工染色体则是一种人工构建的染色体，可以携带非常大的目的基因片段。
人工染色体的优点是它可以稳定地存在于细胞中，而且可以携带多个基因。
但是人工染色体的构建也非常复杂，需要很高的技术水平。
载体在DNA 分子克隆中起着非常重要的作用。
细菌人工染色体技术研究进展
中圈 分 类 号 ： ８ ３ Ｑ １． ４
文献标识码： Ａ
文 章 顺 序 编号 ： ６ ２ ５ ９ （ Ｏ ８ ０ 一 ３ — ４ １７ — １０ ２Ｏ ）５ Ｏ ３ ０
隆 ， 少 用 于 Ｄ Ａ文 库 （ Ｎ ｂａｙ 的构 建 ， 很 Ｎ Ｄ Ａ ｌ ｒｒ） ｉ 尤
其 是 真 核 生 物 的 文 库 构 建 ； 黏 粒 容 量 虽 有 所 增 大
究 中都 有 着 广 泛 的 应 用 ，对 促 进 分 子 生 物 学 研 究
的迅速 发展起到 了重要作 用 但 随着研 究 的深 入 ， 以上 系统 也 逐 渐显 现 了它 们 的一 些 固有 缺 陷 ： 质
粒 系 统 容 量 小 （ ｌ ｈ ，只 适 用 于 一 般 基 因 的 克 ＜ ５ｋ ）
系 ， 在 含 Ｘ ｇｌＩＴ 的 平 板 上 生 长 ４ — ａ、 Ｇ Ｐ ８ｈ后 ， 出
现 １ ０％～ １ ４． ５％的 蓝 色 细胞 ； 同年 Ｂ ｋ ｒ 建 了 ａｅ 构
含 荧 光 素 酶 或 绿 色 荧 光 蛋 白 Ｇ Ｐ的 Ｂ Ｃ载 体 ， Ｆ Ａ
以 此 载 体 克 隆 ７ ～ ７ ｂ 的 人 类 基 因 组 Ｄ Ａ， ０ １０ ｋ Ｎ
繁琐局 限 了它 的使用 。能否建 立一种 容量大 ， 能够 稳定遗 传且 易于操 作 的载 体 系统 成 为众 多分 子生 物学工 作 者的愿 望 真核 基 因组 克 隆载 体 的特点 及其 比较见表 １ ： 细菌人 工 染 色 体 （ ａｔ ｉ ｒｆ ｉ ｈｏ — ｂｃｅ ａ ａ ｉｃａ ｃ ｒ ｒ ｌ ｔｉ ｌ ｍｏ
（ ５ ｂ ， 对于一 些较大 的基 因簇 （ｅ ｅ ｌｓ ｒ ＜４ ）但 ｋ ｇｎ ｕｔ ） ｃ ｅ 的研究 仍然无能 为力 ； Ａ Ｙ Ｃ系统 容量很 大 （ 至数 可 Ｍ ） ｂ ，已被广泛应 用于 Ｄ Ａ文 库的构 和基 因簇研 Ｎ
克隆载体与表达载体
克隆载体
基因间隔区（intergenic region, IG 区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。
② IG区内只有一个Bsu I 切点。
（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。
M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。
使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。
而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 kb
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。
能像
-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。
cos序列是噬菌体 DNA 中将DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。
黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（amp r），cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。
克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。
有的粘粒载体含有两个cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。
质粒载体总结
λ噬菌体载体
表达载体。