白蛋白胆红素结合耦合脂质体

白蛋白胆红素结合耦合脂质体:治疗黄疸的影响
摘要：
在本研究中，我们证明了脂质体的适宜性是一种作为去除高胆红素血症大鼠血浆胆红素的方法。

脂质体具有与胆红素结合的疏水相互作用的内在趋势。

不同类型的脂质体中，带正电荷的脂质体被发现对游离胆红素有最大的亲和力。

然而，包封或耦合的血清白蛋白对脂质体的表面可以使他们的胆红素的结合能力成倍增加。

脂质体能够优先结合胆红素是在红细胞的存在下。

有趣的是，这些脂质体，发现取代胆红素结合的红细胞的表面上一样。

本研究的结果进一步表明，白蛋白轴承脂质体去除实验，对于黄疸动物血浆胆红素同样有效。

这些观察表明，脂质体介导的选择性归巢，在治疗高胆红素血症的条件下，多余的血浆胆红素对对模型动物的肝细胞（参见肝细胞）可能有助于安全战略的发展。

2002爱思唯尔科技有限公司保留所有权利。

原文
顺便说一句，胆红素具有高亲和力白蛋白，从而压迫或偶联白蛋白在脂质体的表面,会导致与胆红素结合若干倍的增加。

为了测试我们的假设，我们评估他们的脂质体结合的各种类型的自由以及血浆膜结合胆红素。

最后，我们确定这些脂质体是否将促进肝细胞摄取和矢量胆红素的转运。

在体内的研究表明，基于胆红素降低配方，不仅有助于脂质体复合物的形成也促进胆红素在模型动物的全身血液循环。

2。

材料和方法
2.1。

材料
蛋磷脂酰胆碱（卵PC）是从蛋黄中分离和纯化，如前所述。

胆固醇（CHOL）是从印度孟买原子核研究实验室购买，胆固醇结晶三次后用甲醇。

硬脂胺（SA），phophatidyl丝氨酸（PS），神经节苷脂，氰基硼氢化钠，游离脂肪酸的白蛋白（各种动物源）和胆红素均购自西格马。

高碘酸钠、乙二胺四乙酸（EDTA）是从印度孟买西斯科研究实验室购买。

Sephadex G-75和Sepharose 6B从Pharmacia精细化学品采购。

2.2。

方法
2.2.1。

胆红素溶液的制备
考虑到这一事实，市售的胆红素中污染杂质可能会干扰脂质体–胆红素结合研究和纯化后公布的程序。

再结晶的胆红素（5毫克）溶解在38mL的碳酸钠溶液含有1 mL EDTA 1毫升（pH11.0）。

该解决方案是以5000 rpm离心10分钟，除去不溶性胆红素。

胆红素的溶液的pH值和Tris缓冲生理盐水调整到8（10mL，150mL氯化钠，pH 7.6）。

在453nm下，用摩尔消光系数分光光度法测定胆红素的浓度6.2*10^4/M/cm。

胆红素溶液避光，防止光降解和在制备最低为30分钟。

所有的实验都进行了排除日光光源，使用覆盖双层橙色玻璃，在440 nm的发射非常少的照明。

2.2.2。

脂质体的制备
在本研究中，胆红素被允许在不同的物理化学性质的脂质体的相互作用。

各种类型的脂质体组合物如下：
中性脂质体：蛋PC和胆固醇（7:3摩尔比）
带负电荷的脂质体：蛋PC，胆固醇和PS（7∶2∶1摩尔比）
带正电荷的脂质体：蛋PC，胆固醇和SA（7∶2∶1摩尔比）
白蛋白耦合[人血清白蛋白（HSA）/ ]脂质体：蛋PC，胆固醇和神经节苷脂
白蛋白耦合/包埋（HSA /）脂质体：蛋PC，胆固醇和神经节苷脂（20:20:4摩尔比）单层脂质囊泡（ulvs）通过超声波方法以下公布的程序在我们的实验室制备的改性。

简单的，所需的脂质成分溶解在氯仿–甲醇的混合物在厚厚的玻璃管，和溶剂被缓慢的射流的N 2获得很薄的脂质膜管壁上下被移除。

溶剂的痕迹留在真空除去管中一夜。

这薄层是分散
在0.8毫升的硼酸盐缓冲液（10 mM硼酸，氯化钠60毫米，ph8.4）。

在4摄氏度氮气环境下，脂质超声探头的超声波发生器的分散为30分钟（脉冲模式，3秒的脉冲2 秒的间歇）。

在10000 rpm ，4摄氏度，用RC5C散热离心机超声处理制备的钛颗粒一小时，去除分散不良的脂质。

只有前三分之二的上清液进行进一步的研究。

这些脂质体的平均粒径，通过负染色电子显微镜测定，大概是60+/-10 nm。

2.2.3。

与脂质体血清白蛋白共价偶联
在脂质体包封的血清白蛋白冻融法–其次是耦合的白蛋白在脂质体表面的影响。

从各种来源的血清白蛋白共价连接到脂质体的表面，如前所述。

简要，脂质体进行的脂质体的表面上存在的神经节苷脂对产生式的醛基的高碘酸盐氧化。

随后，囊泡在1.5*15cm 高碘酸盐分离交联葡聚糖G-75column平衡在20 mL硼酸盐，氯化钠120mM（ph8.4）。

采用RC 3B冷却离心机（1500转，4摄氏度），脂质体的峰值集中在一个超过滤centriflo锥。

为了结合，氧化脂质体（10微摩尔每一毫升）进行混合，在0.5毫升的20 mM硼酸盐给定的血清白蛋白10毫克,120mM的盐水（ph8.4）。

上述混合物中加入15微升的NaBH 3 CN（2M）和反应混合物在室温下放置14小时。

非耦合的白蛋白通过该混合物1.6*90cm的琼脂糖6B柱去除，与蔗糖平衡补充三盐水（10mMTris，44mM蔗糖，氯化钠120mM和5mMEDTA，pH 7.4）及白蛋白偶联脂质体中的空隙体积洗脱。

对应于囊泡的峰又名马苏德。

生物化学与生物物理学报1564 /周期等（2002）219 226 220–集中使用centriflo锥如上。

蛋白质在HSA /脂比脂质体80微克每微摩尔脂质PI，而这是对HSA /脂质体的脂质PI 96微克每微摩尔，用BCA 试剂法估计。

2.2.4。

体外胆红素结合到脂质体
37摄氏度下，胆红素溶液在各种脂质体制剂中，测定脂质体的胆红素结合动力学。

在浓度，以及时间依赖的方式研究了相互作用。

简单地说，在37摄氏度Tris缓冲液（10 mM Tris，150mM盐水，pH 8。

）中，脂质体（62.5 —500 nmol 脂质Pi/500微升）用500微升2:1胆红素/白蛋白混合物孵育（总胆红素150 微摩尔）1 h 。

未结合胆红素在1.5*30cm的交联葡聚糖G-75柱平衡三10mM,150mM的NaCl溶液（pH 8）。

采用RC 3B冷却离心机（1500转，4摄氏度），脂质体的峰值集中在一个超过滤centriflo锥。

我们还确定胆红素在脂质体的存在下，分离的红细胞和全血的结合。

简要地说，在人类红细胞的存在（1*10^8个细胞）下，37 条件下，脂质体（250nmol脂质PI）是以2:1的胆红素/白蛋白孵育混合（总胆红素150微摩尔）1 小时，保持反应混合物的1毫升的最终体积的Tris缓冲生理盐水。

通过孵化脂质体已经饱和的胆红素的红细胞，研究了胆红素与脂质体与红细胞表面相对相互作用。

简单地说，胆红素饱和红细胞（1 *10^8 细胞胚胎）孵育与各种脂质体制剂（250 nmol 脂质Pi) 1 小时在37 摄氏度条件下，保持最终体积1 mL，用Tris缓冲液。

脂质体进行分离，在4摄氏度2000转下，离心10分钟，脂质体结合胆红素估计为前面描述的。

同样地，红细胞的潜力，以取代脂质体绑定胆红素被研究通过允许他们与胆红素饱和脂质体进行交互。

简单地说，250 nmol 脂质Pi 被允许与红细胞交互（1*10^8 细胞一小时在37摄氏度下。

在2000 rpm 4摄氏度下，使用RC 3B 离心机离心30 分钟，分离红细胞和脂质体。

在2000转离心4摄氏度下，分离10分钟进一步清洗。

脂质体以及红细胞分析其胆红素含量在公布的程序。

2.2.5。

在脂质体的体外细胞毒性试验
采用MTT微培养四氮唑法使用公布的程序[ 20 ]测定了不同的脂质体制剂的毒性。

简要地说，人类胚胎肾（HEK）在指数生长的细胞期收获和离心分离5分钟在2000*克，完全悬浮在培养基。

在37摄氏度，细胞在96孔板中的分配（180微升DMEM中有2*10^4个细胞）和在孵育5%加湿的CO 2孵化器。

24小时后，20微升脂质体溶液在六个重复的说给0–2000纳米脂质体（脂质PI）终浓度为每毫升。

在37摄氏度培养48 h后，20微升的MTT（原液
5毫克/毫升PBS）被添加和板再培养4 h后，介质通过抽吸除去。

二甲基亚砜（150 Al）被添加到每口井，并结合被溶化的轻轻摇动。

板块在540nm微孔板阅读器被立即阅读（Ceres uv900c，生物科技仪器，美国）。

威尔斯用完全培养基，脂质体法和MTT法，但没有细胞，作为空白。

硫酸长春新碱（40 nm）是能够诱导100%杀死的细胞和作为阳性对照。

2.2.6.体内相互作用的脂质体与梗阻性黄疸大鼠血浆胆红素水平
雄性Wistar 大白鼠被曝光使用，三个候补天内制定出高胆红素血症足月条件胆红素/大鼠血清白蛋白（RSA）（摩尔比2：1）解决方案。

每一种动物收到 1 毫升的胆红素/RSA 解决方案对应75 uM 胆红素每剂量；前两个剂量均由皮下路线，紧接着最后静脉注射的相同数量的胆红素（75 uM 1 毫升等渗缓冲区中）管理。

动物分为六个不同的小组；每个由包含10 动物。

1.正常大鼠不给予任何治疗
2.高胆红素血症大鼠给予没有脂质体治疗
3。

高胆红素血症大鼠给予自由的RSA处理
4.高胆红素血症鼠给予PC脂质体治疗。