细胞工程课件

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红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物
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细胞培养和原植物的天然产物量的比较
物 种 天然产物 产 细胞培养 量 原 植 物
橘叶鸡眼藤 蒽醌 决 明 蒽醌 长 春 花 蛇根碱 三角叶薯蓣 薯蓣皂苷 人 参 人参皂角苷 烟 草 烟碱 烟 草 泛醌 大 红 罂 粟 蒂巴因
900微克/克干重 鲜重的0.334% 干重的1.3% 26mg/克干重 鲜重的0.38% 干重的3.4% 0.5mg/克干重 130mg/克干重
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植物组培基本过程
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预备阶段（1）
配MS培养基
1.基本组分：mg/L 蔗糖 3% , KNO3 1900, NH4NO3 1650, CaCl2 440, MgSO4 370, KH2PO4 170, 2.微量无机物：Na2•EDTA 37.3, FeSO4 27.8, MnSO4 22.3, ZnSO4 8.6, H3BO3 6.2, KI 0.83, Na2MoO4 0.25, CoCl2 0.025, CuSO4 0.025 3.微量有机物：mg /L 肌醇 100， 腺嘌呤 5， 甘氨酸 2，烟酸 0.5, 吡咯醇 0.5，硫胺素 0.1，生物素 0.01， 激动素(KT) 0.04—10 吲哚乙酸（IAA） 1—30 24 4. Agar 10 g /L
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二. 动物细胞工程
• 1885 Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天； • 1903 Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月； • 1907 美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长 出轴突； • 1914 Tomson创立能在培养基中维持器官小块的 方法； • ？ Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长， 使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限 生长；
细 胞 工 程
CELL ENGINEERING
——改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程
刘广发
《细胞工程》主要内容（1）
• • • • • • • 细胞工程的基础知识与基本技术； 植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术；
单倍体植物的诱发和利用
动物细胞融合 植物脱病毒技术 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 人类干细胞研究
罗应学
高嘉 周立 蒙冰 王恒
细胞重构与动物克隆
杨欣蔷
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探究式自主学习安排（2）
课 题 顺序 8 动物细胞与组织培养 9 动物细胞融合 10 细胞重构与动物克隆 学习小组
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染色体转移与基因转移
•6-苄基腺嘌呤（6-BA）：先 加少量0.1mol/L的NaOH和蒸 馏水稍加热使其溶解；
•萘乙酸（NAA）：先用少量 95%乙醇和少量0.1mol/L的 NaOH溶解；
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不同植物的最适pH值
种类
杜鹃 越桔
最适pH值
4.0 4.5
种类
月季 胡萝卜、 石刁柏
最适pH值
5.8 6.0
蚕豆
番茄
5.5
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第一章 细胞工程发展简史
一. 植物细胞工程
• 1902 德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具 全能性； • 1904 德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长 成植株； • 1922 Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺 绿的叶和根； • 1930-34 李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏 胚正常生长； • 1934 美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠 10 根尖病毒愈少；
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动物细胞工程
• 1940 Earle建立可无限传代的小鼠结缔组 织L系； • 1951 Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela 细胞系； • 1958 冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水 瘤细胞融合； • 1960s 童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移 植，获核质杂种鱼；
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动物细胞工程
• • • • 1960 Barski成功进行小鼠细胞融合实验； 1965 Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞； 1967 Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失； 1975 Kohler & Milstein创立淋巴细胞杂交技术，获单克 隆抗体； • 1997 英国Willmut以体细胞成功克隆“Dolly”羊； • 1998年，人类胚胎干细胞被首次培养成功； • 1999年，日本医学家宣布，实现人肝细胞在体外增殖；
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《细胞工程》主要内容（2）
动物细胞与组织培养 动物细胞融合 细胞重构与动物克隆 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 染色体转移与基因转移 人类干细胞研究 原核细胞的原生质体融合 真菌细胞的原生质体融合
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参考文献
• 自编. 细胞工程讲义 • 罗立新等. 细胞工程. 华南理工大学出版 社，2003 • 李志勇编著. 细胞工程. 科学出版社， 2003
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长芽生根阶段
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移栽成活阶段
• 保湿是关键； • 避免强光直射； • 温度适宜；
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植物组培的优缺点
• 优点：
A B C D • 缺点： A B C

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手指玫瑰
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第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产
• 本方法的历史、现状


1956年，Routier & Nickell首先提出把植物细胞 当作工业合成天然产物的途径； 1968年，Reinhard, Corduan & Volks经培养生 产出“哈尔碱”（harmine); 1972年，Furuya & Ishii经培养生产出“维斯纳 精”（Visnagin); 1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”； 1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”， 达到60mg/L； 目前世界最大的细胞培养罐达20 t；
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植物不同器官的消毒和处理 • 种子
纯酒精浸10 min，无菌水洗净，次氯酸钙（10％）浸 20～30 min，无菌水洗3～5次，无菌滤纸吸干； ；
• 果实
纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2％）浸10 min，无菌水 反复冲洗，剥除种子和内部组织；
• 茎切段
自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2％）浸15～20 min，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干；
先加少量 碱液预溶
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继代增殖阶段
• 移植扩增； • 分割继代；
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光照培养室
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生根长芽阶段
• 生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分 化具有协同作用，它们的量以及比例的 不同配合，对细胞分化起着重要的作用； • 外植体本身内源激素水平的差异，导致 它们分化时对培养基中所添加的这两种 激素量及其比例反应不尽相同；
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植物细胞工程
• 1972 Carlson用NaNO3成功融合不同烟草 的原生质体； • 1977 Kao（高国南）首创PEG- 高钙高pH 值细胞融合法； • 1978 Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物； • 1985 Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、 日本和法国相继开展 人工种子研制；
5.7
桃
7.0
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预备阶段（2）
• 选择合适的外植体 外植体大小要适宜； 外植体的部位影响其分化能力和器官分 化的类型； 外植体的年龄影响其分化率； 同一植物不同部位的分化需不同的生长 素/激动素比例； 不同物种的相同部位外植体分化能力不 一样；
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预备阶段（3）
• 除菌
自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗
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探究式自主学习计划
• • • • • • 自愿组成学习小组，3人左右，选出组长； 每组选一个主题，时间约10 min； 各组需准备PowerPoint; 各组最高可得8分； 其他同学可提问、补充或更正； 教师讲评和讨论；
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探究式自主学习安排（已选）
顺序 1 2 3 4 5 6 7 8
课 题 学习小组
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基本操作
2.细胞培养 取样 灭菌 培养 传代 除菌 取样 3. 细胞融合 原生质体 融合 筛选 4. 转基因细胞（个体）
收获
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第三章 植物细胞工程
主要内容：
• • • • • • 植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术；
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第二章 细胞工程的基础知识与基本技术
一. 基础知识 1. 原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易 于操作；但具细胞壁，表达真核基因 受一定限制。 2. 真核细胞：接近人类需要，但具细胞 周期，要同步化培养；生长慢，植物 细胞和真菌细胞具细胞壁。
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二.基本操作
1. 无菌操作概念与技术 无菌室布局、卫生、消毒、超净台
人工种子制备 原生质体制备与细胞融合（植物）
原核细胞的原生质体融合
真菌细胞的原生质体融合
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细胞工程的三个层次
• 细胞水平：细胞培养, 细胞融合，整株培 养； • 细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞 器； • 基因水平：基因转化；
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开展细胞工程的意义
• 研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及 其特点； • 有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品 种的步伐； • 可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组 织或生物； • 有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产； • 可获得脱毒植物；
110微克/克干重 种子干重的0.21% 干重的0.26 % 20mg/克干块根 鲜重的0.3~3.3% 干重的2~5% 16mg/克干叶 140mg/克干叶
外植体
无菌滤纸吸干
无菌外植体
切割
若干块无菌外植体置培养基上
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常用消毒剂的使用和效果