大肠杆菌苹果酸合酶A的酶学和生理功能研究
酶
酶活力，规定为：在最适反应条件（25℃）下，每
分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定为 一个酶活力单位，即1U=1μmol/min。
酶的催化作用受测定环境的影响，因此测定
酶活力要在最适条件下进行，即最适温度、最适 pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等，只
性失活；（3）酶是两性电解质，在不同pH下呈现不
同的离子状态（4）和蛋白质一样具有胶体性质；（5） 具有蛋白质所具有的化学呈色反应。
2. 酶的组成分类
酶作为一种具有催化功能的蛋白质，与其它蛋白质 一样，相对分子质量很大，一般从一万到几十万以至大
到百万以上。
从化学组成来看酶可分为单纯蛋白质和结合（缀合） 蛋白质两类。属于单纯蛋白质的酶类，除了蛋白质外， 不含其它物质，如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和核 糖核酸酶等。属于结合蛋白质的酶类，除了蛋白质外， 还要结合一些对热稳定的非蛋白质（辅助因子）小分子 物质或金属离子，其酶蛋白（脱辅酶）与辅助因子结合
酶反应的速度曲线
反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。因此，研
究酶反应速度应以酶促反应的初速度为准。
2. 酶的活力单位（U, activity unit）
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位 表示，即酶单位（U）。 酶单位的定义是：在一定条件下，一定时间内 将一定量的底物转化为产物所需的酶量。
1961年国际生物化学协会酶学委员会及国际纯
一、习惯命名法
1961年以前使用的酶的名称都是习惯沿用的，称为 习惯名。
1. 根据酶作用的底物命名，如淀粉酶、蛋白酶。 2. 根据酶催化反应的性质及类型命名，如水解酶、氧 化酶等。 3. 结合上述两个原则命名，如琥珀酸脱氢酶。 4. 在这些命名的基础上，加上酶的来源或其它特点， 如胃蛋白酶、胰蛋白酶。
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质李倩;徐美娟;夏海锋;饶志明【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2011(030)002【摘要】以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000.选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%.并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适PH值为6.0,在PH值2.0～6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好.K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用.醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性.酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47 μmol/(L·min).【总页数】6页(P267-272)【作者】李倩;徐美娟;夏海锋;饶志明【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏,无锡,214122;江南大学,生物工程学院,江苏,无锡,214122【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质 [J], 魏涛;孙浩;申玉龙;毛多斌2.牦牛MDHⅡ基因克隆表达及脂代谢候选基因关联性分析 [J], 陈露露;王会;王吉坤;柴志欣;王嘉博;陈智华;信金伟;姬秋梅;钟金城3.丙酮酸甲酸裂解酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质的研究 [J], 杨登峰;韦宇拓;周兴;黄志民;黄日波4.大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质 [J], 于平;刘航;朱鹏志;胡淳玉;杨柳贞;贺敏;马健5.鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备 [J], 丁忠庆;刘胜旺;孔宪刚;宋铭忻因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用
基金项目国家级大学生创新创业训练项目（20221135041）。
作者简介盛明俊（2002—），男，安徽安庆人，从事食品质量与安全研究。
通信作者马龙（1979—），男，安徽蚌埠人，博士，副教授，从事食品科学与工程研究。
收稿日期2023-11-16L-苹果酸的生产方法、生理功能及其应用盛明俊詹凯马龙（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠233000）摘要L-苹果酸是一种天然有机酸，易溶于水和乙醇，其作为良好的食品酸味剂，被广泛应用于食品工业。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
关键词L-苹果酸；酶转化；细胞转化法；微生物发酵法；食品工业中图分类号TS201.2；S377文献标识码A文章编号1007-7731（2024）01-0082-06苹果酸，又名2-羟基丁二酸，分子式为C 4H 6O 5，相对分子质量为134.09。
苹果酸的分子中存在一个不对称碳原子，有2种异构体，在大自然中以D-苹果酸、DL-苹果酸和L-苹果酸3种形式存在。
D-苹果酸难以被人体吸收利用，经过化学合成法生产出来的DL-苹果酸可能具有一定的毒性，而L-苹果酸可以被人体吸收利用，并且具有一定的生理功能[1]。
本文介绍了L-苹果酸的生产方法和生理功能，探究了酶转化或细胞转化法和微生物发酵法的研究进展，综述了L-苹果酸在食品工业中的应用情况，对L-苹果酸在食品工业中的应用前景和生产方法的研究方向进行了展望，为L-苹果酸的进一步研究提供参考。
1L-苹果酸的生产方法L-苹果酸的生产方法由直接提取法、化学合成法发展到目前的酶转化或细胞转化法和微生物发酵法等。
1.1直接提取法L-苹果酸广泛存在于蔬菜和未成熟的水果中。
直接提取法的操作原理是先将未成熟的苹果、葡萄和桃的果汁或蔬菜汁煮沸，后加入石灰水，得到钙盐沉淀；随后将钙盐转变为铅盐，并经处理得到游离酸，即可得到L-苹果酸。
聚苹果酸聚合途径中苹果酰辅酶A连接酶基因的克隆、表达及酶学性质
1. 2 苹果酰辅酶 A 连接酶核心片段克隆 根据苹果酰辅酶 A 连接酶的保守序列设计兼
并引物，以 Core1F、Coer1Ｒ 为 兼 并 引 物 进 行 PCＲ 克 隆得 到 核 心 片 段。 反 应 条 件 为: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个 循 环;72℃ 10 min; 25℃ 10 min。PCＲ 产物连接 pMD 19-T Vector 载体， 测序验证。 1. 3 IPCＲ 法扩增苹果酰辅酶 A 连接酶基因全长
目前，聚 苹 果 酸 生 产 方 式 主 要 有 化 学 合 成 和 微 生物发酵法。早 在 1969 年，Shimada 等［2］ 发 现 一 种 以苹果酸为结构单元的聚合物能够抑制圆弧青霉菌 的酸性蛋白酶活 性，最 终 证 实 为 聚 苹 果 酸;之 后，从
多头 绒 泡 菌 Physarum polycephalum 和 出 芽 短 梗 霉 Aureobasidium pullulans 中 分 离 得 到 聚 苹 果 酸［3 － 4］。 相比多头绒泡菌，出 芽 短 梗 霉 具 有 更 好 的 聚 苹 果 酸 合成能力［5］，本课题 组 也 分 离 得 到 一 株 聚 苹 果 酸 高 产菌 株 A． pullulans CCTCC M2012223，采 用 固 定 化 纤维床反应器，聚 苹 果 酸 发 酵 产 量 达 到 123. 7 g / L， 并建立 了 聚 苹 果 酸 酸 水 解 制 备 苹 果 酸 新 工 艺 技 术［6 － 7］。
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌株、载体和试剂:出芽短梗霉( A． pullulans CCTCC M2012223) 由 西 南 大 学 药 学 院 发 酵 工 程 研 究室 筛 选 保 藏，用 于 基 因 克 隆。 大 肠 杆 菌 BL21 ( DE3) 用于蛋白表达，表达载体 pET-32a ( + ) 购自 Novagen( Germany) ，克 隆 载 体 pMD 19-T 购 自 大 连 宝生物工程公司。限制性 内 切 酶 BamH Ⅰ、HindⅢ、 EcoＲⅠ、Ex Taq 酶 购 于 大 连 宝 生 物 工 程 公 司; T4 DNA ligase，Taq DNA polymerase 购 于 TransGen 公 司;胶回收试剂盒 ( Axygen) 、质 粒 小 提 试 剂 盒、酵 母 基因组提取试剂盒、考 马 斯 亮 蓝 蛋 白 测 定 试 剂 盒 购 于 TIANGEN 公 司; DNase Ⅰ，ＲNase-Free 购 于 Fermentas 公司;反转录试剂盒购于 Thermo 公司;真 菌 ＲNA 提取试剂 盒 购 于 Omega 公 司; Ni-NTA 纯 化 柱购于上海新睿生物科技有限公司;其余试剂均为 国产分析纯。 1. 1. 2 培养基 及 培 养 条 件:PDA 培 养 基 ( g / L) :土 豆 200，葡萄糖 20，自然 pH，121℃ 灭菌 30 min，固体 培养 基 添 加 1. 6% 的 琼 脂，用 于 A． pullulans 的 培 养;LB 培 养 基 ( g / L ) : 蛋 白 胨 10，酵 母 提 取 物 5， NaCl 10，121℃ 灭菌 20 min，固 体 培 养 基 添 加 1. 6% 的琼脂。 1. 1. 3 实验所用引物:根据 NCBI 公布的苹果酰辅 酶 A 连接酶 基 因 序 列，通 过 生 物 信 息 学 分 析，设 计 简并引物，表中 下 划 线 表 示 引 物 的 识 别 位 点，括 号 中的字母表示限制 性 内 切 酶 酶 切 位 点，引 物 由 南 京 金斯瑞生物科技有限公司合成。
大肠杆菌植酸酶appa在毕赤酵母中的高效表达
大肠杆菌植酸酶AppA在毕赤酵母中的高效表达高娇，郑学云，林影，梁书利（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）摘要：本研究全基因合成大肠杆菌B48来源的植酸酶AppA基因，并将它克隆到PHKA载体上，在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。
为了进一步提高毕赤酵母中植酸酶的表达量，本研究结合信号肽、启动子、基因剂量和蛋白质折叠通量优化的方法，最终将毕赤酵母中植酸酶的活力从329.41 U/mL提高到了1892.51 U/mL，是初始菌株的5.75倍。
初步测定了植酸酶AppA的基本酶学性质，其最适温度和pH分别为60 ℃和4.5；在60 ℃处理60 min后，植酸酶活力剩余40%，温度稳定性较差；在pH 6.0~7.0处理6 h后，酶活力剩余87%，该酶在弱酸环境中有较好的稳定性；同时研究了二价金属离子对植酸酶活力的影响，Fe2+能够激活植酸酶AppA的活力，而Cu2+、Ni2+、Mn2+等离子通过与植酸形成络合物而抑制植酸酶AppA的活力。
该酶在酸性条件下的强稳定性有利于将其应用于食品加工领域。
关键词：毕赤酵母；植酸酶；表达元件；基因剂量；调控因子文章篇号：1673-9078(2019)12-137-144 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.12.018 Efficient Expression of Escherichia coli AppA Phytase in Pichia pastorisGAO Jiao, ZHENG Xue-yun, LIN Ying, LIANG Shu-li(Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering, School of Bioscience and Bioengineering, South ChinaUniversity of Technology, Guangzhou 510006, China)Abstract: In this study, the phytase gene, AppA, derived from Escherichia coli B48 was synthesized by whole gene, and cloned into PHKA vector for secretion expression in Pichia pastoris GS115. In order to further increase the expression of phytase in Pichia pastoris, this study adopted the optimization method based on the combination of signal peptide, promoter, gene dose and protein folding flux, which led to an ultimate increase of the phytase activity in Pichia pastoris from 329.41 U/mL to 1892.51 U/mL (5.75 times as high as that of the original strain). The basic enzymatic properties of phytase AppA were preliminarily determined, and the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 4.5, respectively. After a 60-min treatment at 60 ℃, 40% of the phytase activity was retained, indicating poor thermal stability. After a 6-h treatment at pH 6.0~7.0, 87% of the enzyme activity was retained, indicating good stability in a weak acid environment. The effect of divalent metal ions on phytase activity was also studied. Fe2+ could activate phytase AppA, while ions such as Cu2+, Ni2+ and Mn2+ may inhibit the activity of phytase AppA through forming a complex with phytic acid. The high stability of the enzyme under acidic conditions is advantageous for its application in the field of food processing.Key words: Pichia pastoris; phytaseAppA; expression element; gene dose; regulatory factor植酸酶是水解植酸及其盐类生成肌醇和磷酸的一类酶的总称。
大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质
ｄｒ ｍ ａ ｉａ ｌ ｍ ｐ ｏ ｅ ｔ ｈｅ ｍ ａ ｔ ｂ ｌｔ ｆＭ Ｄ Ｈ ． Ｗ ｈｅ ａ ｏ ｃ ｔｃａ ｉ ｓｕｓ ｄ ａ ｕ ｔ ａ ｅ， ａ ｔｃ ｌｙ ｉ ｒ ｖ ｈｅｔ ｒ ｌｓ ａ ｉｉｙ ｏ ｎ ｏｘ ｌ ａ ｅ ｉ ｃ ｄ ｗａ ｅ ｓｓ ｂｓ ｒ ｔ
大肠 杆 菌 苹果 酸脱 氢酶 基 因 ｍｄ ｈ的克隆 、 高效 表 达及 酶 学性质
李 倩 ， 徐 美娟 。 夏 海锋 ， 饶 志明 叫 ， 。
（ ．江 南 大 学 工 业 生 物技 术 教 育 部 重 点 实 验 室 ， 苏 无 锡 ２ ４ ２ ；２ 江 南 大 学 生 物 工 程 学 院 ， １ 江 １１２ ．
苹 果 酸 脱 氢 酶 （ Ｃ １ １ １ ３ ， ｈ 广 泛 分 布 Ｅ ． ． ． ７ ｍｄ ）
公 司 ； ｉ、 Ｄ ： 自 Ｓｇ Ｔｒ Ｓ Ｓ 购 ｓ ｉｍａ公 司 ；还 原 型 酰 胺 腺
在动物组 织 、 生物 和植 物 中口 。它 是 一种 活性 较 微 强 的酶 ， 存在 于 乙醛 酸体 、 粒 体 、 氧 化 物 体 、 线 过 叶 绿体 、 细胞浆 、 以及 锥 虫 甘 油体 内。ｍ ｈ为多 聚 体 ｄ
ｔ ｅｅ ｚ ｍｅ ｋｎ ｔｃｃ ｎ ｔ ｎ ｓｏ ｈ ｎ ｙ ｉ ｅｉ ｏ ｓａ ｔ ｆＫｍ ｎ ａ ｄ Ｖｍａ ｓ０ ２ ５ ｍｍｏ／ ｎ ． ７ Ⅱ ｌ（ ・ｒｉ ） ｘ ｗａ ． ３ ｌ Ｌ ａ ｄ ０ ４ ｍｏ ／ Ｌ ａ ｎ ，
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中 图分 类 号 ： ８ ４ Ｑ １ 文 献 标 识 码 ：Ａ
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大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5〜10g/L的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L后外源蛋白的表达完全被抑制。
解脂耶氏酵母异柠檬酸脱氢酶基因的克隆与表达
大肠杆菌苹果酸脱氢酶的原核表达、纯化与酶活力测定摘要：苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)普遍存在动物、植物、细菌等多种生物体中，负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换，在细胞的多种生理活动中发挥重要作用，如C4循环、光合作用、TCA循环。
本实验从实验室保存的DH5α重组菌中提取pET28b-mdh重组质粒，并对其进行双酶切鉴定。
将重组质粒pET28b-mdh转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中，通过卡那霉素和氯霉素抗性进行筛选。
挑取单菌落培养至菌体浓度OD600≈0.6时，用0.1 mM的IPTG诱导表达MDH蛋白，然后收集、纯化MDH蛋白并分析其酶活力。
结果表明，MDH在大肠杆菌中获得了高量表达，MDH还原草酰乙酸的活力为194.75 U/mg。
关键词：苹果酸脱氢酶；原核表达；活力测定Expression and Purification of Malate Dehydrogenase from Escherichia coli and its Activity DeterminationAbstract: Malate Dehydrogenase is ubiquitous in animals, plants, and bacterias, which catalyzed the interconversion of oxaloacetate and malate linked to the oxidation/reduction of dinucleotide coenzymes, which play a key role in many metabolic pathways such as TCA cycle, photosynthesis, C4 cycle and so on. In this study, we extracted pET28b-mdh recombinant plasmid from DH5α, which was preserved in our laboratory, and examined the recombinant plasmid correctness through double enzymes digestion reaction. Then we transformed the recombinant plasmid into E.coli Rosetta(DE3) and screened the positive recombinant strain thought kalamycin and chloromycetin resistance. And then we cultured the individual colony until OD600≈0.6, then added IPTG to the finally concentration 0.1mM to induce the expression of MDH. We collected and purified the MDH and then analyzed MDH enzyme activity. The result showed that MDH can be highly induced to express in E.coli and its activity to reduce oxaloacetate is 194.75 U/mg. Keywords: malate dehydrogenase; prokaryotic expression; activity assay1 前言1.1苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH; EC 1.1.1.37)普遍存在于动物、植物和细菌等各种生物体中，是生物体糖代谢的关键酶之一。
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大肠杆菌苹果酸合酶A的酶学和生理功能研究王程;王敖;赵旵军;朱国萍【摘要】Malate synthase is one of the key enzymes in glyoxylate cycle. The aceB gene, encoding malate synthase A ( MSA) , was amplified from the genomic DNA of Escherichia coli MC1655 using PCR with primers designed according to the sequence of E. coli genome. The PCR product was cloned into pET-29b( + ) , resulting the recombinant plasmid pET-MSA. The target protein ( MSA) was overexpressed in E. coli Rosetta ( DE3) under IPTG induction, and then the enzyme was purified to homogeneity. The molecular weight ( MW) of MSA was about 60 kDa. The optimal pH and temperature of MSA were pH 8. 0 and 30 C, respectively. The maximum activity of purified MSA was observed in the presence of Mg2+ . The Km and Vmax values for acetyl-CoA of MSA were 8. 07 μM and 3. 6μM/min, respectively. Furthermore, the mutant strains, MG: : ΔaceB with MSA deletion and MG: : ΔaceBΔglcB with MSA and malate synthase G( MSG) deletion, were constructed, respectively. It was observed that the growth rate of the mutant E. coli strain with MSA deletion was remarkably lower than that of the wild-type strain, indicating that MSA was essential for E. coli growth on acetate. Although MSG was able to partially recover the function of MSA , the glyoxylate bypass containing MSA was the much more effective metabolic pathway of glyoxylate.%苹果酸合酶是乙醛酸循环的关键酶之一.E.coli中苹果酸合酶A(malate synthase A,MSA)由aceB基因编码.根据E.coli基因组序列设计引物,利用PCR技术扩增aceB基因,并将其克隆入pET-29t,(+),构建了重组表达质粒pET-MSA.经IPTG诱导,MSA在E.coli Rosetta(DE3)中获得高效表达.纯化的MSA蛋白的分子量大小约为60 kDa,最适反应pH值和最适温度分别是pH值8.0、30℃.纯化的蛋白质在Mg2+存在时才能发挥最大的活性,其对乙酰辅酶A的Km和Vmax分别是8.07μM和3.6μM/min.此外构建了MSA和苹果酸合酶G(MSG)基因敲除菌株MG::AaceB和MG::AaceBAglcB.研究发现缺少MSA的E.coli突变菌株在乙酸中的生长速率要比野生型菌株慢很多,表明MSA对大肠杆菌在乙酸中的生长起着重要作用.MSG虽然能部分补偿MSA的作用,但是包含MSA的乙醛酸旁路是更有效的乙醛酸代谢途径.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】5页(P39-42,46)【关键词】苹果酸合酶A;表达;动力学;生长速率;大肠杆菌【作者】王程;王敖;赵旵军;朱国萍【作者单位】安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;芜湖市第二人民医院检验科,芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q7SAbstract:Malate synthase is one of the key enzymes in glyoxylatecycle.TheaceBgene,encoding malate synthase A(MSA),was amplified from the genomic DNA ofEscherichia coliMG1655 using PCR with primersdesigned according to the sequence ofE.coligenome.The PCR productwas cloned into pET-29b(+),resulting the recombinant plasmid pET-MSA.The target protein(MSA)was overexpressed inE.coliRosetta(DE3)under IPTG induction,and then the enzyme was purified to homogeneity.The molecular weight(MW)ofMSA was about60 kDa.The optimalpH and temperature ofMSA were pH 8.0 and 30 C,respectively.Themaximum activity of purifiedMSA was observed in the presenceofMg2+.TheKmandVmaxvalues for acetyl-CoA ofMSA were 8.07μM and 3.6 μM/min,respectively.Further more,the mutantstrains,MG::ΔaceBwithMSA deletion andMG::ΔaceBΔglcBwithMSA andmalate synthase G(MSG)deletion,wereconstructed,respectively.Itwasobserved that the growth rate of themutantE.colistrainwithMSA deletion was remarkably lower than that of the wild-type strain,indicating thatMSA was essential forE.coligrowth on acetate.AlthoughMSGwas able to partially recover the function ofMSA,the glyoxylate bypass containingMSA was themuchmore effectivemetabolic pathway of glyoxylate.Keywords:malate synthase A;expression;kinetics;growth rate;Escherichia coli乙醛酸循环又称乙醛酸途径,是三羧酸循环的回补途径,两者之间存在着某些相同的酶类和中间产物。
乙醛酸循环中有两个关键性酶,即异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase,ICL)和苹果酸合酶 (malate synthase,MS),前者催化异柠檬酸生成乙醛酸和琥珀酸,而后者催化乙醛酸和乙酰辅酶 A缩合形成苹果酸和辅酶 A。
乙醛酸循环的终产物将参与糖异生途径以及其它的生物合成途径[1]。
乙醛酸循环在古菌、细菌、真菌、原生动物以及萌发的植物种子中均有发现[1-2]。
此外,一些研究报道在脊椎动物中也发现了 ICL和MS的活性,尽管人们认为这些动物中并不存在乙醛酸循环。
在微生物和高等植物幼苗以 C2化合物为原料合成碳水化合物的过程中,乙醛酸循环起着十分重要的作用[3]。
同时,一些研究也指出在分枝杆菌 (M ycobacteria)中,病菌的持续感染能力与乙醛酸循环直接相关[4]。
苹果酸合酶有两种同工酶,即苹果酸合酶A和苹果酸合酶 G,分别简称为MSA和MSG。
MSG仅存在于细菌中,而 MSA在细菌、真菌和植物中都有发现。
E.coli同时含有这两种苹果酸合酶,其中MSA由 aceB基因编码,参与乙醛酸循环,MSG由glcB基因编码,与乙醇酸盐(glycolate)的利用有关[5]。
本文依据 GenBank中已报道的 E.coli基因组序列,克隆了 aceB基因,实现了高效表达与纯化,并对MSA的酶学性质进行了鉴定。
另一方面,利用染色体同源重组技术敲除了 E.coliMG1655中的 aceB基因和glcB基因,通过测定缺陷型菌株的生长速率,对 MSA的生理功能进行了初步研究。
1.1 材料1.1.1 菌株和质粒E.coliMG1655和DH5α为本实验室保存,质粒pET-29b(+)及宿主菌E.coliRosetta(DE3)由中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室周丛照教授惠赠。
1.1.2 培养基和试剂LB、SOB、SOC和MD培养基的配方见文献[6]。
生长曲线测量时使用的乙酸-MOPS和葡萄糖-MOPS培养基中分别包含 2%的乙酸和 2%的葡萄糖,如文献所述[7]。
DNA聚合酶、限制性内切酶购于 New England Biolabs,T4 DNA连接酶、质粒提取试剂盒(W izard®Plus SVminipreps DNA Purification System)、胶回收试剂盒(W izard®SV Gel and PCR Clean-Up System)购于 Promega公司,高保真PrimeSTAR®HS DNA聚合酶购于TaKaRa公司,标准蛋白分子量购于Fermentas公司,蛋白质纯化试剂盒购于 Clontech公司。