guan6外源基因在真核细胞中的表达
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guan-6-外源基因在真核细胞中的表达
提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象， 譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表 达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组 成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整 人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5’ 非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5’ 非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。 限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外 源蛋白是否能在其中获得高产。
当細胞被病毒感染后，30 min后出現RNA，16-20
h后大量放出未包裹的病毒， 约在24 h后病毒进 行包裹，在60-72 h后細胞開始瓦解。下图的细胞 已是受感染80 h后的状态，在显微镜下可以观察 到盐粒状的多角体病毒。
左图是一只正常的菜造成虫体的死亡， 右图則为baculovirus造成虫体的细胞瓦解。
酵母表达系统 yeast expression system- Pichia pastoris 昆虫表达系统 Insect expression system-Baculoviruses 哺乳动物细胞表达系统 Mammalian expression system
外源基因在真核表达系统中表达的3环节： 载体的构建； 构建的载体DNA在真核细胞中的导入； 表达产物的鉴定
三、筛选标志基因
很少通过细胞的形态来鉴定和筛选被转染的 细胞，利用筛选标志基因的表达产物赋予细胞 的特性而区分细胞。
四、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方 式
昆虫细胞和杆状病毒提供了已经被证明的 高水平表达哺乳动物全长蛋白的方法。 在昆虫细胞中很多翻译后修饰类似于哺 乳动物细胞，而那些在大肠杆菌中不能 成功表达的蛋白也可以在昆虫细胞利用 杆状病毒系统进行表达。
第7讲 克隆基因的表达与产物纯化-外源基因在真核细胞中的表达课件
酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用 作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在 无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组 蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。
酵母菌表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的 甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中 各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基 因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤 酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以 外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在 此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷 贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴 斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS已被用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相 似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所 不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA 上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵 母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该 系统中获得成功表达。
酵母菌中的野生型质粒 乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两 种不同的双链线状质粒 pGKL1和pGKL1 拷贝数为50-100个，分别携 带K1K2两种能使多种酵母 菌致死的毒素蛋白编码基 因（α β γ），同时含有毒 素蛋白抗性基因。
酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建 ARS plasmid：从酵母菌的染色体中截取一段ARS element， ARS是表示Autonomously replicating sequence。 ARS-containing plasmid的稳定性较差，质粒常被分 解而无法代代相传 。 但是若加入一段centromere (CEN) sequence (称CEN plasmid)，就可使质粒稳定性提高。 但是其copy number较低，一般只有 single copy。
外源基因在真核细胞中的表达
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿
色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能吸 收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿 色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用 同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生 物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。
外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分
子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的
探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能
从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？
又是如何对转化的真核生物进行鉴定？
一、选择标记基因和报告基因：
1. 基因转化的选择标记
选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化 前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞 群体臵于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时， 已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该 基因的产物---酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转 化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地 生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择 剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制
外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制外源基因指的是不同于自身天然基因的DNA序列，也称为异基因。
它们通常来自其他生物体或者人工合成。
将外源基因导入真核细胞中，可以用于基因治疗等生物学应用。
但是，外源基因在真核细胞中的转录与翻译机制是如何实现的呢？本文将从转录与翻译两个方面进行探讨。
一、外源基因的转录在真核细胞中，外源基因的转录需要利用细胞核内的RNA聚合酶Ⅱ及其辅助因子。
具体而言，首先，在外源基因导入真核细胞后，其中的DEAE（二乙氨基乙烷磺酰氯）结构可以与细胞核膜上的负电性磷脂结合，从而增加外源基因进入细胞核的概率。
其次，外源基因所带有的启动子因子通常与细胞内自身基因的启动子因子不同，因此，需要利用转录激活因子（transcriptional activator）来激活RNA聚合酶Ⅱ。
这些转录激活因子可以通过识别外源基因启动子上的绑定位点，与RNA聚合酶Ⅱ的载体克服反式构象的阻碍，使其启动并开始转录。
最后，转录过程中所合成的外源mRNA需要经过RNA后处理过程。
比如，转录的外源mRNA首先要剪切成正确的3’端与5’端，接着经过去除内含子、加上头部甲基等修饰，最终整合成成熟的mRNA。
这一过程让外源mRNA得以正常运作，供翻译酶读取序列信息。
二、外源基因的翻译外源基因的翻译与自身基因类似，需要使用细胞质内的翻译体系。
通常来说，外源蛋白的合成与自身蛋白合成的过程没什么不同，遵循着标准的mRNA翻译规则。
具体而言，首先，mRNA上的翻译起始密码子（AUG）被识别后，tRNA带着对应的氨基酸A（甲硫氨酰胺）进入到翻译终点—核糖体R（ribosome）上。
其次，核糖体R从mRNA的5’端不断向3’端移动，逐渐合成蛋白。
这一过程中，外源基因上的密码子和tRNA发生配对，tRNA合成链不断变长，新合成的肽链不断生长。
最后，当核糖体R到达mRNA终止密码子时，翻译过程终止，蛋白质合成结束。
需要注意的是，由于外源蛋白和自身蛋白在A、T、G、C序列的组合上并无区别，因此在翻译过程中往往会和自身蛋白一同被翻译和进入细胞质中。
【精品】七=外源基因在真核细胞中的表达与调控182页PPT
【精品】七=外源基因在真核细胞中 的表达与调控
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
谢谢你的阅读
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
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第九章外源基因在真核细胞中的表达
选择标记之一
二氢叶酸还原酶基因
氨甲喋呤（methotrexate, MTX）和三甲氧 苄二氨嘧啶（trimethoprim）是二氢叶酸类似物， 是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，当培养基中 含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生 长受到抑制。有一种突变的DHFR，它不受MTX 的抑制，以它作选择标记，转化的细胞可在含 MTX的培养基上生长。
二、DNA直接导入的
基因转化方法
1 聚乙二醇法 2 高压电穿孔法 3 显微注射法 4 基因枪法 5磷酸钙共沉淀法
6 脂质体介导法 7 激光微束穿孔法 8 超声波介导法 9 DEAE-葡聚糖法 10 原生质体融合法
聚乙二醇诱导基因转化
外源DNA加聚乙二醇（polyethylene glycol， PEG）和二价阳离子（如Mg2+、Ca2+、Mn2+）可 在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的 内吞作用导入细胞。用多聚赖氨酸或多聚鸟氨酸 代替PEG也行，二价阳离子常用CaCl2或MgCl2。 植物细胞必须除去细胞壁，可用纤维素酶降解细 胞壁，在等渗溶液中分离得到原生质体。
绿色荧光蛋白
The Nobel Prize in Chemistry 2008
“for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP”
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien 钱永健
三、农杆菌作载体的 植物转基因方法
农杆菌属于根瘤菌科土壤杆菌属 （Agrobacterium），常用的两种植物基因工程载 体农杆菌是根癌农杆菌（A. tumefaciens）和发根 农杆菌（A. rhizogenes），其中根癌农杆菌是植物 转基因工程中应用最广泛的载体系统。
第六章 克隆基因的表达(2)
(3) 显微注射法 又简称为微注射法，它是创造转基因动 物的有效途径。其技术关键如下： ① 理想外源基因的制备。这种基因可处于质粒上，但注 射前质粒已经酶切而线性化。有的载体DNA会干扰外源 基因的表达，因此注射前，需要先从载体上将它们切下 。 ② 收集受精卵。在受孕后的几小时内，父母双方的遗传 物质还未结合前，从供体动物中取出单细胞的受精卵。 ③ 显微注射。利用极细的毛细玻璃管(外径为0.5—1um) ，将理想的遗传物质注入受精卵的雄原核。这必须在父 母双方遗传物质融合前的4h间歇期内完成。当双亲染色 体相遇后，注入的理想基因有可能整合到染色体上。 ④ 在几次细胞分裂后，将带有理想基因的受精卵移入母 体，使受精卵孕育。
(2)电击法
原理是，在很强的电压下，细胞膜会出现 电穿孔现象。经过一段时间后，细胞膜上的小 孔会封闭，恢复细胞膜原有特性。据此原理设 计的电击法可用于基因转移。电击法具有简便、 快速、效率高等优点，但在植物中，由于细胞 壁对外源基因的摄取有不利影响，所以一般以 原生质粒为受体细胞。目前，该法用于烟草、 玉米、水稻、小麦、高梁和大豆等植物，已得 到了稳定的外源基因表达。
(2)复制型载体(YRp)
YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠 杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA片段不但提 供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA的 自主复制顺序(ARS)。
因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复 制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可 以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称 为穿梭载体(shuttle vector)。穿梭载体在基因工 程中广泛使用。
(1) 整合型载体(YIp)
YIp型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA 片段构成的，如PYeleul0是由Co1E1质粒和酵母 DNA 提 供 的 亮 氨 酸 (Leu2+) 片 段 构 成 。 由 于 leu 2+基因片段不含自主复制起始区，只作为选择 标记，所以YIp型载体在酵母细胞中不能自主复 制。YIp型载体可经转化作用导入受体细胞，进 入细胞后的YIp质粒DNA通过与受体染色体DNA 的同源重组，被整合到染色体上，并随染色体 一起复制。这样质粒DNA以单拷贝基因形式稳 定地遗传。
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②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括 启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、 mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序 列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源 基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。
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第一节外源基因在毕赤酵母中的表达
酵母是目前最常用的表达系统之一。 优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进
限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外 源蛋白是否能在其中获得高产。
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2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转 化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载 体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细 胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制 整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得 多拷贝。
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4、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌 方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工 程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌 表达的方式。
有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如 果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对 因子(MFa1)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小 的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号 表达外源基因获得成功的可能性大。
随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各 种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之 有效。
而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核 表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工 业化生产等优点。
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3
原核表达系统： 大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统
外源基因在真核表达系统中表达的3环节： 载体的构建； 构建的载体DNA在真核细胞中的导入； 表达产物的鉴定
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真核表达载体至少要含两类序列：
①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起 始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等， 以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系 统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够 使用的数量。
1、外源基因特性
外源基因在（巴氏毕赤酵母）Pp中表达时，其自身就 是影响表达水平的重要因素。
不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过 提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的 产量。
Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷 贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高
行翻译后加工和修饰
巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）用于基因工程表达外源 蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高；
可以建立有效的分泌型表达；（分泌型表达？）
减轻宿主的代谢压力，减少受蛋白酶降解 的危险，方便产物的纯化，也利于二硫键 的正确折叠。
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7
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
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3、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得 到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加 表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组 CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获 得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因 子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高 拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点 杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对 产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在 过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适 的mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因 的表达不尽人意。
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提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象， 譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表 达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组 成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整 人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5’ 非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5’ 非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。
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高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准
Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将 菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放 在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌 蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检 测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法， 每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大 量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上 清液中获得了255mg的重组cD40L。
外源基因在真核 细胞中的表达
Expression In Eukaryotic Host Cells
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1
DNA
Gene copy number Promoter activity
RNA protein
mRNA stability Ribosome binding site Codon usage Protein stability
Many host-dependent factors
Biological activity
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2
人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德 国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有 生物活性的蛋白质——胰岛素。
优势：高产量，操作简便
缺陷：较多哺乳动物蛋白基因很难在此系统表达 产生有功能的蛋白
原因——蛋白表达后的正确折叠和修饰
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真核表达系统：
酵母表达系统 yeast expression system- Pichia pastoris 昆虫表达系统 Insect expression system-Baculoviruses 哺乳动物细胞表达系统 Mammalian expression system
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第一节外源基因在毕赤酵母中的表达
酵母是目前最常用的表达系统之一。 优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进
限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外 源蛋白是否能在其中获得高产。
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2、表达框的染色体整合位点和方式
虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转 化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载 体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细 胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制 整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得 多拷贝。
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4、分泌信号
对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌 方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工 程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌 表达的方式。
有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如 果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对 因子(MFa1)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小 的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号 表达外源基因获得成功的可能性大。
随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各 种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之 有效。
而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核 表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工 业化生产等优点。
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原核表达系统： 大肠杆菌表达系统、枯草杆菌表达系统
外源基因在真核表达系统中表达的3环节： 载体的构建； 构建的载体DNA在真核细胞中的导入； 表达产物的鉴定
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真核表达载体至少要含两类序列：
①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起 始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等， 以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系 统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够 使用的数量。
1、外源基因特性
外源基因在（巴氏毕赤酵母）Pp中表达时，其自身就 是影响表达水平的重要因素。
不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过 提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的 产量。
Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷 贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高
行翻译后加工和修饰
巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）用于基因工程表达外源 蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高；
可以建立有效的分泌型表达；（分泌型表达？）
减轻宿主的代谢压力，减少受蛋白酶降解 的危险，方便产物的纯化，也利于二硫键 的正确折叠。
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影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
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3、基因剂量
许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得 到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加 表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组 CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获 得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因 子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高 拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点 杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对 产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在 过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。
A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适 的mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因 的表达不尽人意。
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提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象， 譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表 达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组 成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整 人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5’ 非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5’ 非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。
因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。
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高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准
Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将 菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放 在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌 蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检 测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法， 每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大 量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上 清液中获得了255mg的重组cD40L。
外源基因在真核 细胞中的表达
Expression In Eukaryotic Host Cells
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1
DNA
Gene copy number Promoter activity
RNA protein
mRNA stability Ribosome binding site Codon usage Protein stability
Many host-dependent factors
Biological activity
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人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德 国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。
在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有 生物活性的蛋白质——胰岛素。
优势：高产量，操作简便
缺陷：较多哺乳动物蛋白基因很难在此系统表达 产生有功能的蛋白
原因——蛋白表达后的正确折叠和修饰
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真核表达系统：
酵母表达系统 yeast expression system- Pichia pastoris 昆虫表达系统 Insect expression system-Baculoviruses 哺乳动物细胞表达系统 Mammalian expression system