常用微生物染色方法共25页文档
常用的微生物染色方法
几种常用的微生物染色方法1简单染色不同的细菌，或者由于观察者所侧重观察的内容不同一，所以所使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。
先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上菌膜区域，以覆盖菌膜为准。
按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤(见图5-2)。
最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。
如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。
2芽孢染色法芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的细菌能产生内孢子，这些孢子耐高温、干旱及有毒化学试剂。
内孢子还能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。
然而，芽孢一旦着色后就很难脱色。
虽然芽孢通常可在革兰氏染色片中看到(芽孢由于不易让染料进入多呈现无色),但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，更便于观察。
其实验的操作方法与革兰氏染色类似。
主要的芽孢染色法有以下两种。
(一)孔雀绿染色法(1)将生有芽孢的斜而菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液(约为7.6%)染10 min。
(2)用自来水冲洗。
(3)用0.5%番红液复染30%.(4)水洗，吸干。
(5)镜检：芽孢呈绿色，菌体和芽抱囊呈微红色，但应注意菌体中有异染粒时，也可呈绿色。
(二) 石炭酸复红染色法(1)按常规涂片。
(2)滴加石炭酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸气但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5 min。
(3)涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色至无红色染剂洗脱为止。
(4)彻底水洗。
(5)用吕氏美蓝复染2 min -3 min。
(6)水洗、吸干。
(7)镜检：镜检时，菌体及孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。
具体实验时，在对一些特殊芽孢染色时，需要对染色液和复染液进行修改。
3鞭毛染色鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，直径一般为10nm~20 nm,超出了光学显微镜的观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到鞭毛。
常用微生物染色方法
WOIRD格式革兰染色抗酸染色：分支杆菌属，诺卡放线菌属。
石炭酸复红染色，金永染色。
芽孢染色：用于区分细菌的芽孢和营养细胞。
结果芽孢染成绿色，营养细胞为红色。
晶体染色：观察苏云金杆菌不同变种的晶体形状大小。
结果晶体染成紫色，芽孢为透明椭圆形，仅见具有轮廓的折光体。
鞭毛染色：有赖夫生染色法、银盐染色法，西萨-基尔染色法等。
一般以西萨-基尔（Cesares-Gill）染法效果最佳。
异染颗粒染色：用于白喉棒状杆菌染色，直接涂片或改良阿伯特法染色。
墨汁荚膜染色：观察菌体有无荚膜，如新型隐球菌。
碳素墨汁。
镀银染色：螺旋体吉姆萨染色：螺旋体荧光染色魏申染色（wayson）染色：鼠疫耶尔森杆菌。
铬酸P、A、S真菌类染色。
结果：曲霉菌、念球菌属、细胞浆菌属、隐球菌属为红紫色。
曲霉菌丝周边紫红色，弹力纤维紫色，背景绿色。
Mann氏甲基蓝伊红染色法：病毒包涵体染色。
Negri氏小体红色。
Nacchiavello氏染色：病毒包涵体染色。
结果：包涵体、立克次氏体均染红色，其余组织呈蓝色。
Crocott-Gomori氏六胺银法：新型隐球菌碘染色法吉姆萨染色：衣原体乳酸酚棉蓝染色，糖原染色：真菌，前者适用于所有真菌，呈蓝色。
吉姆萨染色，瑞氏染色：鞭毛虫，滴虫，锥虫，疟原虫，弓形虫，隐孢子虫等原虫。
三色染色，碘染色：阿米巴等原虫。
荧光素吖啶橙染色：疟原虫。
金胺-酚染色：隐孢子虫。
甲苯胺蓝，四胺银染色：耶氏肺孢子虫。
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常用微生物染色方法-精选文档
革兰染色意义
鉴别细菌
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
选择药物
革兰氏阳性菌对青霉素等敏感 革兰氏阴性菌对链霉素等敏感
与细菌的致病性有关
革兰氏阳性菌产生外毒素 革兰氏阴性菌产生内毒素
抗酸染色
原理：结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌， 因其菌体表面有一层类脂或脂质而不易着色，但 一经着色后酸或已醇的作用亦是不易脱色。利用 此特性并以增强的染色液染色，然后再用酸及乙 醇加处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性 菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），而其他 细菌及背景中的物质为蓝色。
二 等电点学说 酒精可使细胞壁脱水，间隙变小，
三 化学学说 通透性降低，阻碍结晶紫-碘复合
物渗出；
革兰氏阴性菌细胞壁结构比较
疏松，肽聚糖层很薄，外膜、脂 蛋白、脂多糖均含有大量脂质， 易被酒精溶解，致使细胞壁通透 性增高，细胞内的结晶紫-碘复合 物被酒精溶解洗出而脱色。
原理
一 通透性学说
二 等电点学说
常用微生物染色方法
泰兴市人民医院检验科微生物室 刘鸿丽
1、革兰染色 2、抗酸染色 3、墨汁染色
革兰氏染色
革兰氏染色原理
一 通透性学说 二 等电点学说 三 化学学说
LPS 磷壁酸
肽聚糖层 磷脂层
G- / G+ 细菌细胞壁比较示意图
革兰氏阳性菌细胞壁结构比较
原理
致密，肽聚糖层很厚，脂类含量
一 通透性学说 较少，酒精不易渗入，而且95％
三 化学学说
革兰氏阳性菌等电点（pH 23）比革兰氏阴性菌等电点 （pH 4-5）低，加之媒染剂 碘为弱氧化剂能降低革兰氏 阳性菌的等电点，因此在同 样的pH的染色环境中，阳性 菌所带负电荷比阴性菌多， 与带正电荷的结晶紫染料能 牢固结合，不易被酒精脱色。
几种常用的微生物染色方法汇总
·健康科学·几种常用的微生物染色方法汇总黄波因微生物细胞比较小且透明，在普通的光学显微镜下不容易进行观察。
染色以后微生物细胞会与背景形成比较鲜明的色差，从而可以清楚地观察到微生物的形态，有利于鉴别、强化细化或细胞组分与周围环境之间产生的反差，方便利用普通光学显微镜对微生物细胞进行观察的简便方法。
一、微生物染色原理因微生物细胞含有大量的水分，所以对光线的吸收、反射及水溶液之间的差异不明显，机体属于无色、透明样，且与周围的环境背景之间也没有明显的反差，在普通的光学显微镜下不容易进行识别，所以必须对微生物进行染色，经过染色以后，菌体会与背景有明显色差的形成，才能更加清楚地观察到其形态与结构。
微生物细胞主要是有由蛋白质、核酸等两性电解质以及其他的化合物所组成，所以会表现出两性电解质的性质。
而两性电解质又兼具了碱性基、酸性基，在酸性溶液当中，会解离出含有碱性基呈碱性带正电；在碱性溶液当中，会解离出酸性基呈酸性带负电。
经过测定后，细菌等电pH值在2~5之间，所以在中性、碱性或是偏酸性的溶液中，细菌的等电点均小于上述中溶液的pH值，因此，细菌是带负电荷，容易和带正电荷的碱性染料相互结合，所以应用碱性染料色的比较多。
此外，微生物体内的各种结构的结合力与染料不同，所以可以使用各种染料对微生物的结构分别进行染色，便于观察。
二、染料的种类与选择染料可以分为2种类型：①天然染料，包含胭脂虫红、地衣素、石蕊、苏木素等，大部分都是从植物中所提取的，成分较为复杂。
②人工染料，又被称为煤焦油染料，大部分都是从焦煤油中所提取的，属于苯的衍生物。
大部分染料都属于带色有机酸或是碱类，有的也与有机溶剂相溶，为了使其能够在水中易溶，通常会把它们制作成盐类。
染料按照电离后的染料离子，所带的电荷性质，将其可分为以下几种类型。
（一）酸性染料该类染料进行电离以后，染料离子带负电，例如伊红、刚果红、苯胺黑等，可以和碱性的物质进行结合，成为盐；当培养基为糖类，而分解产酸的时候会使pH值下降，同时细菌所带的正电荷会增加，这时应该选择酸性染料，微生物容易被染色。
临床微生物室常用染色方法
临床微生物室常用染色方法一、革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。
原理：1、等电点学说。
2、化学学说。
3、通透性学说。
试剂1、结晶紫溶液A液：结晶紫2g95%乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml需在用前24 h将A液，B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2、碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml将碘与碘化钾混合并研磨，加入少量水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
3、脱色液：95%乙醇4、复染液A：贮存液：沙黄 2.5g95%乙醇100mlB：应用液：A液10ml蒸馏水90ml(应用液也可用：石炭酸复红10ml加90ml蒸馏水）染色方法1、涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。
（用滤纸吸去玻片上水分）2、加碘液染1min，水洗。
（吸去水分）3、加脱色液，不时摇动约10～30秒，至无紫色脱落为止，水洗。
（吸去水分）4、加复染液，染30秒,水洗。
（吹干）5、镜检。
二、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
厚涂片时，须掌握染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
（厚涂片的同时，涂薄片一张）。
原理分枝杆菌细胞壁含脂质较多其中主要成份为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
试剂1、萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液（碱性复红8克，溶于95%乙醇100亳升）碱性复红乙醇饱和溶液：10ml5%石炭酸溶液：90ml2、脱色剂：浓盐酸3ml95%乙醇97ml3、复染液（吕弗勒美蓝液）美蓝乙醇饱和溶液（美蓝0.3g，溶于95%乙醇30ml中）美蓝乙醇饱和溶液：30ml20%氢氧化钾：0.1ml蒸馏水：100ml染色方法1、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
实验三—细胞的活体染色 共25页
(3)染色后撕开组织块，这样溶液中就会有一 些细胞或细胞群。
(4)用吸管吸取溶液，放在载玻片的Ringer氏 液中。垫两根短头发，加盖玻片，即可镜检。
(5)用油镜观察活染色的线粒体标本，要不断 地来回转动细调焦螺旋，使盖玻片上下慢慢移动。使
液。
3、1／5000詹纳斯绿B
先配制1％詹纳丝绿B溶Ringer氏溶液，方法同上。
4、台盼蓝染色液
将l克台盼蓝溶于100毫升生理盐水中
5、香柏油、二甲苯、蒸馏水等。
实验方法：
(一)液泡系的中性红活体染色 l、用双面刀片将黄豆芽根尖 (约l一 2cm2) 处小心纵切断面，一定要薄且均匀。 2、在载玻片中央滴加中性红染料。使 材料在其中染色5一10分钟。 3、吸去染料，滴加Ringer氏液一滴， 盖片、镜检、注意液泡系染成什么颜色， 其形态、大小如何、分布位置。
(二)线料体的活体染色 l、用植物细胞观察线粒体的活体染色 (1)用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块
(约lcm2)，放在载玻片上用1/5000詹纳斯 绿B染色约30分钟。 (2)吸出染液，滴加Ringer氏液，盖片、
镜检，注意观察线粒体分布及所呈形 状。
2、用Байду номын сангаас物细胞观察线粒体的活体染色。
(1)取鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入盛 有Ringer氏液的表面皿中洗去血液。
谢谢！
xiexie!
实验四 细胞活体染色技术
讲解者：张学娇 学 号：01011034 日 期：2019/10/26
基本介绍 实验目的 概念 实验原理 实验用品 实验方法 注意事项
基本介绍：
常见的三种微生物染色方法
常见的三种微生物染色方法学院：生命科学专业：生物科学年级：2010级姓名：王亚军摘要：在用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察细菌的形状及某些细胞的结构。
通过对细菌的简单染色可初步认识细菌的形态特征；通过革兰氏染色可将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性;通过对细菌的芽孢染色可初步了解芽孢杆菌的形态特征。
通过这三种常见的微生物染色方法，可对微生物的形态结构进行观察。
关键词：染料革兰氏染色无菌技术芽孢引言：学会油镜的使用；学会对细菌进行涂片；学习无菌操作技术；学会革兰氏染色法及芽孢染色法；了解芽孢杆菌的形态特征，观察押宝的形态、大小、着生位置。
用于为生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予化合物颜色的特征，助色基团则给予化合物能够成盐的性质仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。
染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类，但在微生物染色中，碱性染料较常用。
常用的碱性染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红、孔雀绿等。
实验内容：一、细菌的简单染色1、原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，碱性染料在电离时，其分子染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
故可用单一的碱性染料对细菌进行染色。
2、器材：（1）仪器：显微镜、酒精灯等（2）实验材料：菌种：枯草芽孢杆菌四联球菌染色剂：齐氏石碳酸复红染液3、操作步骤：（1）先将载玻片洗净，擦干。
（2）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌从斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。
（3）晾干：让涂片自然晾干。
(4)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
(5)染色：滴加染液于涂片上，然也刚好覆盖涂片薄膜即可。
微生物的制片染色技术
微生物的制片染色技术微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。
至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均需经特殊方法染色后，才能进行观察。
细菌的制片染色细菌涂片的制作与简单染色涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。
注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。
简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。
此方法用于观察细菌外形及大小。
革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。
用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。
染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。
镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。
革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。
因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。
此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。
特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。
芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。
芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。
常用的微生物染色方法
常用的微生物染色方法微生物染色是微生物学研究中非常重要的方法，通过染色可以使微生物的形态和结构更加清晰，便于观察和研究。
下面将介绍几种常用的微生物染色方法。
1. 革兰氏染色法（Gram染色）：革兰氏染色法是最常用的微生物染色方法之一、该方法可以根据细胞壁结构的差异将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，可以保留紫色的革兰氏染料-碘-酒精复合物，呈紫色；而革兰氏阴性菌由于细胞壁较薄，无法保留染料-碘-酒精复合物，经酒精洗涤后以褪色方式显现嫩蓝色。
2. 去瓶球菌染色法（Ziehl-Neelsen染色）：该染色方法主要用于诊断结核菌感染。
结核菌具有酸酒杆菌的特征，该染色方法通过热定性进行，即将杆菌加热固定在玻璃片上。
染色液为仲子红与甲苯红的酒精醚溶液，结核菌上的脂质物质可以吸附染色液，呈现红色。
3.金黄色葡萄球菌染色法：金黄色葡萄球菌染色采用的是接种在含有豆粉和盐的琼脂糖平板上的细菌进行。
染色液为碘酸钾和碘甘液的混合物，在细菌细胞内部染出棕色团块。
4. 吉姆萨染色法（Giemsa染色）：吉姆萨染色法主要用于染色血液细胞、细菌和寄生虫等。
染色液为吉姆萨染料溶液，通过染色液和蒸馏水的混合来染色。
吉姆萨染色方法对捕获染色成分极为敏感，将蓝色碱性染料用于碱性碳水化合物和核酸材料，将红色和紫红色酸性染料用于酸性成分，如蛋白质和细胞质组分。
5. 格拉姆-韦瑞染色法（Gram-Weigert染色）：该染色法用于菌体内基质和胞外多糖的特异染色。
六元蔗糖银试剂与格拉姆染色特殊染料结合，生成黑色的沉淀物，用以观察菌体内多糖地点和部位。
6.碘染色法：碘染色用于染色藻类和真菌。
该染色法主要原理是将菌丝或细胞的内部特异性细胞器染为紫黑色，以便更容易观察和研究。
7.寇歇染色法：寇歇染色法主要应用于真菌的染色，染色方法与碘染色类似，可以观察到真菌菌丝和孢子的形态和结构。
总结起来，微生物染色方法有很多种，每种方法适用于特定的微生物和研究目的。
常用微生物染色法
1革兰染色法：2.1.1染色剂的配制1.1.1结晶紫液称取结晶紫2.0g，加95%乙醇20ml，使溶解为甲液，另取草酸铵0.8g，加水80ml，使溶解为乙液。
甲、乙液相混，静置48小时后使用。
贮存在密闭的棕色瓶中。
有效期为3个月。
1.1.2碘液称取碘化钾2.0g，加水3~5ml，使溶解，再投入碘1.0g，用力振摇，使之全部溶解，加水稀释至300ml，即得，贮存在棕色瓶中。
密闭保存，有效期为1个月。
1.1.3脱色液：95%乙醇。
1.1.4复染液：a.沙黄（番红）复染液：称取沙黄0.25g，加95%乙醇10ml溶解，然后再加纯化水至100ml即得。
b.稀石碳酸复红染液：称取碱性复红2.5g，研细，加95%乙醇25ml。
放置过夜，用滤纸过滤，加5%石碳酸水溶液20ml混合，为石碳酸复红液，再取此液10ml，加水90ml，即成稀石碳酸复红液。
1.2染色操作方法：1.2.1涂片、干燥在载玻片上，滴一滴无菌水或生理盐水，用接种环挑少许菌苔在水涂成一薄层；或将长菌的培养液取少许轻轻涂在载玻片上，自然干燥，也可以在微火焰上通过几次，使菌体固定。
1.2.2染色步骤a滴加结晶紫液，覆盖约1分钟，水洗，（勿使水直接冲洗涂片处）。
b滴加碘液，覆盖约1分钟，水洗、吸干。
C用95%的乙醇褪色至脱色乙醇不呈紫色为止，约20~30秒，水洗吸干。
D滴加沙黄染液或稀石碳酸复红染1分钟，水洗吸干。
1.2.3染色结果革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
1.3注意事项1.3.1涂片必须洁净无油，以免影响涂片质量。
1.3.2涂片的菌量不可太浓厚，否则看不清单个菌落形态。
易出现假阳性。
1.3.3用火焰固定时，不可过热，以载玻璃片不烫手为宜。
1.3.4一般以检查培养18—24小时的菌为宜，革兰氏阴性菌染色反应较稳定，不受菌龄的影响。
革兰氏阳性菌易受菌龄影响，较老的细胞如培养24—48小时以上，则有部分或全部细胞转成阴性反应，所以培养18—24小时染色镜检为宜。