(武大张楚富版生化)第十九章.DNA的复制和修复
DNA的复制与修复
DNA聚合酶Ⅲ • 多功能酶
5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 5’ 3’外切酶(切单链) • 不对称二聚体 单体1-前导链/单体2-后随链 • DNA 复制的主要酶 高续进性 高聚合酶活性 高产物真实性
DNA连接酶
• 催化二段DNA链之间3’,5’ 磷酸二酯键的形成
5’ ATP
3’
O 5’
OH O- P O
•第二阶段以成环滚环复制（looped rolling replication）产生多个子代RF；
•第三阶段以RF的负链为模板进行滚环复制产生多拷 贝正链单环。（RF>SS）。
阶段Ⅰ：以（+）链为模板形成RF
♠ 引物的组装
•PriA PriB PriC组合成复合物。 •PriA PriB PriC再加上DnaT DnaB DnaC 构成预引物。 •预引物再结合引物酶形成引物体。
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
前导链
3’
5’ 岗崎片段
半不连续复制
3’ 5’ 后随链
E. coli dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP 是不能做为DNA合成的底物，这样它就不再能加入 DNA中。
尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它 可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点 （apurinic or apyrimidinic, AP）,再由AP内切 酶在AP位点切除一个缺口，进一步进行切除修复。
52KD
ε
ε
α
α
θ
θ
τ
τ
τ亚基维持二聚体 图 11-24 DNA 聚合酶Ⅲ的组成及各部分的功能 图 11-25 DNA 聚合酶 Ⅲ全每的装配过程
DNA的复制、修复和重组
非细菌重组所必需 噬菌体编码
• 整合宿主因子（integration host factor，IHF）
宿主编码
• Xis蛋白：改变DNA结构，使其对整合呈惰性
参与切除反应
DNA的复制、修复和重组
DNA的复制、修复和重组
交错7bp切开DNA
DNA的复制、修复和重组
DNA的复制、修复和重组
DNA的复制、修复和重组
DNA的复制、修复和重组
（一）细菌的转座因子
1、插入序列（Insertion Sequence，IS） ——是简单转座模序 只编码起始自己转座的蛋白 转座频率各异
结构特点： 两侧末端为倒转重复序列（inverted repeats） 旁侧为宿主DNA短正向重复序列
DNA的复制、修复和重组
2、转座子 ——带有编码转座功能酶的基因 及抗性（或其他标记）基因
烈性噬菌体
DNA的复制、修复和重组
温和噬菌体
DNA的复制、修复和重组
普遍性转导（generalized transduction）
DNA的复制、修复和重组
• 完全的复制、修复和重组
局限性转导（restricted transduction）
• 特异性转导
• 溶原期时噬菌体DNA整合在细菌染色体特定部位， 噬菌体DNA发生偏差分离，将自身一段DNA留在细菌 染色体上，而带走了细菌DNA上的基因。
DNA的复制、修复和重组
F因子
• 化学本质是DNA • 以自主状态存在
或整合到细菌的染色体上 • 可在细菌细胞间转移并传递遗传物质
DNA的复制、修复和重组
5’
DNA的复制、修复和重组
性导(sexduction)与F΄因子
DNA的复制和修复机制
DNA的复制和修复机制DNA是构成生命的基础分子，它存储了生物体遗传信息的全部内容。
在生物体繁殖和生长的过程中，DNA需要不断地进行复制和修复。
本文将从DNA复制和DNA修复两个方面来探讨DNA的复制和修复机制。
一、DNA的复制机制在细胞分裂过程中，DNA需要进行复制，以确保每个新生细胞都有完整的遗传物质。
DNA的复制过程是一个高度复杂和密集的事件，在保持准确性和可靠性方面具有重要意义。
1. DNA复制的基本原理DNA复制是由许多复杂步骤组成的，但总的原理是双链DNA 分解成两个单链模板，然后每个模板根据碱基互补规则进行互补匹配，形成新的DNA分子。
具体过程如下：1）双链DNA分离：DNA双链在复制开始前需要分解成两个单链。
DNA双链被酶或蛋白质复合物断开，形成两个单链。
2）DNA合成：DNA配对原则是A对T，C对G。
DNA聚合酶按照这种互补规则将游离碱基从溶液中拾取到新单链上，形成新的DNA双链。
这样，每条单链上的每个碱基都可以通过互补配对获得一个互补匹配的碱基，以恢复新的双链DNA结构。
3）复制完成：参与复制的酶和蛋白分离，复制完成。
2. DNA复制的重要生物分子DNA复制需要多种重要的生物分子参与，包括：1）DNA聚合酶：DNA聚合酶是一种大分子酶，可以将游离核苷酸与模板DNA上的碱基互补配对。
人类DNA中有15种不同类型的DNA聚合酶，它们各自在不同情况下执行DNA复制任务。
2）DNA螺旋酶：DNA螺旋酶能够打开和关闭双链DNA的螺旋结构。
它能解除DNA上的过度的正转和反转扭曲，并且为新合成链的合成提供合适的空间。
3）单链结合蛋白：单链结合蛋白能够保护自由的单链DNA不受降解和修复酶的攻击，从而确保DNA聚合酶能够准确地在正确的位置进行DNA复制。
二、DNA的修复机制DNA的修复是细胞确保DNA稳定性的关键保障，DNA修复机制能够检测和修复DNA链的损伤，从而维持细胞遗传稳定性。
本文将从DNA损伤的类型和DNA修复的方式两个方面探讨DNA的修复机制。
DNA复制和DNA修复的分子机制
DNA复制和DNA修复的分子机制DNA是人类遗传信息的核心，控制着生命的起源和发展。
DNA的重要性在于存储和传递遗传信息，而复制和修复机制则保障了DNA信息的完整性和准确性。
本文将介绍DNA复制和DNA 修复的分子机制以及它们的相互作用与影响。
1. DNA复制的分子机制DNA复制是生物界最基本的生化过程之一，它在细胞分裂中起着核心作用。
它是指将一个双链DNA模板的信息复制到一个新的双链DNA子分子，并同时保留原始DNA分子的完整性和无误差的复制。
DNA复制的过程可以分解为三个阶段：（1）DNA双链分离；（2）DNA单链模板的复制；（3）新DNA双链的合成。
以下将逐个阶段介绍复制中涉及的分子机制。
（1）DNA双链分离DNA双链分离是DNA复制的第一个步骤和限制因素。
DNA双链在每一个DNA复制的起点处，通过融合到一起，在此处展开和暴露单链DNA模板，产生称为“复制泡”的结构。
这个过程主要受到三种因素的影响：（a）终止作用蛋白；（b）前进受阻；（c）原始DNA双链的拓扑结构变化。
大量的研究表明，在细胞分裂过程中，DNA单链的复制机制通过DNA融合合成了大量的蛋白终止作用物质，这些物质在不同的双链DNA断裂位点扮演不同的角色，包括终止复制泡移动、束缚外复制口的结构、保持单链DNA 泡的稳定性和重排DNA双链拓扑结构等等。
（2）DNA单链模板的复制DNA单链模板的复制是复制的核心阶段。
这个过程涉及到三个组分的复杂相互作用：DNA模板、DNA聚合酶和DNA模板的辅助因子。
DNA聚合酶是DNA复制中至关重要的组分，它在复制期间运行，根据单链DNA的模板复制新的DNA链。
DNA聚合酶由细胞核酸和蛋白质组成，仅能在DNA单链的3'端加入核苷酸。
它们会在单链DNA的末端现有核苷酸受到识别和特定引导下，配对新的碱基，并继续进行合成。
DNA模板的辅助因子在复制过程中，调节DNA聚合酶的活性，寻找复制泡的起点和方向并保护DNA聚合酶免受DNA外部条件的干扰。
第四讲：DNA的复制与修复
3‘
5‘
3‘
Discontinuous
5‘
Supported by pulse labeling experiment?
3‘
5‘
3‘
Semidiscontinuous
5‘
实验二：脉冲追逐实验（pulse-chase experiment）
目的是检测早期合成的DNA片段以后发生了如何的变化？ E.coli [t-] pulse-chase in H3-dT , 30’’ continue in H1-dT D.S. DNA S.S. DNA Density gradient of CsCl Measure H3-T
DNA复制时，一条链(前导链)是连续合成的， 而另一条链(后随链)的却是不连续合成的。
DNA复制的过程
（1）复制的起始 双螺旋结构DNA分子在局部解旋为单链，以解开的 一段DNA为模板，形成RNA引物。 （2）复制的延伸 从RNA引物开始连续合成一条链，另一条链以冈崎 片段方式分段不连续合成。 （3）复制的终止 DNA聚合酶水解RNA引物，补填缺口。 连接酶将DNA片段连接起来，形成完整的DNA分子。 DNA重新形成螺旋状。
DNA复制的几种主要方式
（3）D环型复制
（D-loop form replication）
线粒体、叶绿体DNA的一种复 制方式。 亲代双链DNA在DNA复制起 点处被解链开，最初仅以一条 母链作为新链合成的模板合成 互补链。另一条链则成为游离 的单链环，最后再以它为模板 合成另一条链。
DNA复制的 三种推测
DNA复制的起点
● DNA复制是从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称 为复制起点(Origin of replication，ori)。复制过程的复制起点两侧 呈现叉子的形式，故称复制叉。 ●大多数DNA的复制从起点开始双向、等速进行直到终点为止， 每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(Replicon)。
DNA的复制与修复解析
复制叉的推进
起始点
（2） D-环型（D-loop）： 这也是
一种单向复制的特殊方式。这种方式 首先在动物线粒体DNA的复制中被发 现。双链环在固定点解开进行复制。 但两条链的合成是高度不对称的，一 条链上迅速合成出互补链，另一条链 则成为游离的单链环（即D-环）。
核）
D.多起点、双方向
（真核）
原核生物的染色体和质粒、真核生物的 细胞器DNA都是环状双链分子，它们 都是单复制子，都在一个固定的起点 开始复制，复制方向大多数是双向的， 少数是单向复制。
多数是对称复制，少数是不对称复制 （一条链复制后才进行另一条链的复 制）。
（1） 比较形象的－－θ 复制 ZP41
• DNA复制都是在特定起始部位开始。这 一特异部位称为Ori。
• 大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一 个Ori位点，而真核生物染色体中有多个 Ori。
Ori是以一条链为模板起始DNA合成的一 段序列。一般由100-200个碱基对组成， 富含A.T。
1983年，Zyskind等人比较了6种不同种类的 细菌染色体复制起点的DNA序列（包括E.coli、 鼠伤寒沙门氏菌、肝炎杆菌和一种海洋细菌 等），发现它们具有共有序列, 包括二个必需 区域：一个是9bp重复序列，重复出现4次， 能与起始蛋白DnaA特异结合，对于DNA复制 的起始十分重要；另一个是3个连续出现的 13bp序列，富含A和T，有利于双螺旋DNA 局部解旋并暴露两条复制模板链。
1.概念： DNA在复制时，两条链解开 分别作为模板，在DNA聚合酶的催 化下按碱基互补的原则合成两条与 模板链互补的新链，以组成新的 DNA分子。这样新形成的两个DNA 分子与亲代DNA分子的碱基顺序完 全一样。由于子代DNA分子中一条 链来自亲代，另一条链是新合成的， 这种复制方式称为半保留复制。
DNA复制,修复和重组
DNA修复－差错倾向修复所需的酶类。
b. DNA polymerase V和translesion replication
DNA聚合酶V能复制DNA链的损伤位点， 造成高突变率。
第三节 细胞内DNA的遗传重组 （Genetic recombination ，或称基
因重排 Gene rearrangement）
b. 突变的基因间回复（或基因间的抑制）
第二个基因的突变排除或抑制了第一个基 因突变的影响，如抑制子tRNA抑制无意义 突变和错义突变。
二. 肿瘤发生和Ames检测
DNA核苷酸顺序的永久性改变称为突变， 突变的积累导致动物肿瘤的发生。一般的 说诱变剂是致癌物。Ames检测法检出致癌 物：利用一株 沙门氏杆菌组氨酸合成酶缺 陷株。诱变剂（致癌物）可导致基因突变 的回复，使之成为野生型，这原理可用检 出诱变剂。
以上两个过程复制和校对，都依赖碱基 配对中的非共价相互作用，这是提高信 息分子复制高保真度的根本方法。
六. 大肠杆菌有多种DNA聚合酶 1. DNA polymerase I 的特性 5’－3’聚合酶活性；3’－5’外切酶 活性； 5’－3’外切酶活性。
DNA合成速度不及复制叉移动速度的 1/20，16-20 nt/s；
第一节 DNA复制
一. 关于模板的概念（template） 模板分子的概念产生于DNA双螺旋结构 建立之前，能指导子代生物大分子按特 定顺序合成的母链称模板。
二. DNA复制的基本规律 a. DNA复制是半保留的；
b. DNA复制在一个原点（orgin）开始， 双向进行；DNA分子复制的起点称原点， 大肠杆菌的复制原点称OriC，终点区是 ter。DNA复制点呈分叉状，分叉状复制 区域称复制叉。
DNA复制和修复
DNA复制和修复DNA复制是指细胞在分裂过程中，将自身的遗传信息复制出一个完整的复制品。
而DNA修复则是指细胞在DNA受损或出现错误时，通过各种修复机制来修复DNA的完整性和正确性。
DNA复制和修复是生命维持与传递的基本过程，在细胞分裂和生物进化中起着重要作用。
一、DNA复制DNA复制是生物体在细胞分裂过程中进行的重要活动，它确保了新细胞中的DNA完全相同。
1. DNA复制的起点DNA复制始于特定的起始点，称为复制起点。
在这个起始点，DNA双链会被解开形成两个单链，每个单链作为新的DNA模板。
2. DNA复制的酶和蛋白质DNA复制过程中需要多种酶和蛋白质的参与。
首先是DNA聚合酶，它负责将新的核苷酸与模板上的核苷酸配对，形成新的DNA链。
还有其他酶和蛋白质，如DNA解旋酶、DNA连接酶等，它们协助DNA复制的进行。
3. DNA复制的三步骤DNA复制可以分为三个步骤：解旋、配对和连接。
解旋：DNA解旋酶会解开DNA双链，形成两个单链模板。
这是DNA复制的第一步。
配对：DNA聚合酶会按照模板链上的碱基顺序，将新的核苷酸与之配对。
这是DNA复制的第二步。
连接：DNA连接酶将配对好的新核苷酸连接起来，形成新的DNA 链。
这是DNA复制的最后一步。
二、DNA修复DNA修复是细胞对DNA损伤或错误的修复过程，它确保了DNA 的稳定性和可靠性。
1. DNA损伤的原因DNA存在多种损伤原因，包括放射线、化学物质、环境因素和内源性因素等。
这些损伤会导致DNA链断裂、碱基损伤等问题。
2. DNA修复机制细胞有多个DNA修复机制，如直接修复、错配修复、核切修复和碱基切除修复等。
直接修复：某些DNA损伤可以直接被修复酶修复，这种修复方式是最简单的一种。
错配修复：当DNA复制过程中出现错配错误时，细胞会引入错配修复机制，将错误的核苷酸去掉，并重新合成正确的核苷酸。
核切修复：当DNA链发生断裂时，细胞会引入核切修复机制，通过切割并重新连接DNA链来修复断裂。
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第十九章DNA的复制、修复与重组121958年，F.Crick 提出中心法则,揭示了生物体内遗传信息的传递方向：4子代DNA的一条链来自亲代，另一条是新合成的。
★环状DNA复制起点的gene mapping P532图19-3783、复制方向复制方向大多数是双向的，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。
4、DNA的几种复制方式¾（1）直线双向复制单点，原核生物; 多点，真核染色体DNA¾（2）θ型复制：环状双链DNA，单向或双向（E .coli.）¾（3）滚环复制：环状单链DNA，Φx174 p533¾（4）D环复制：线粒体、叶绿体DNA¾（5）多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。
910滚动环复制11E.coli复制叉移动的速率约50Kb/min，复制一代约需40分钟[4.2 ×106/（50Kb ×2）=42]。
富营养时，可采取多复制叉复制方式，20min复制一代。
真核复制叉前进的速率约1000-3000bp/min，采用多复制子（多点）方式，真核染色体复制一代要6-8小时。
131617DNA 聚合酶的反应特点：⑴以4种dNTP 为底物⑵反应需要接受模板的指导⑶反应需有引物3，-OH 存在⑷链生长方向5，→3，DNA 生物合成5’→3’，3. E.coli DNA聚合酶（1）DNA pol I单体酶，催化活性：5，→3，聚合酶活性3，→5，外切酶活性5，→3，外切酶活性大片段（Klenow）：5，→3，聚合活性、3，→5，外切活性。
小片段，5，→3，外切活性18（2）DNA PolⅡ单体酶，催化活性：5，→3，聚合(活性很低)3，→5，外切在DNA修复中起作用。
（3）DNA polⅢ（复制酶）寡聚酶。
DNA polⅢ是合成新链DNA主要的酶，又称复制酶(Replicase)19DNA聚合酶III5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性(校正)★DNA聚合酶的校对功能：错配碱基被3’-5’外切酶切除DNA复制的高保真机制:1.DNA聚合酶的高度选择性2.DNA聚合酶（3’→5’外切酶）的校对功能3.错配修复P539表19-1、19-22021P1. 复制的起始DNA的双螺旋解开合成RNA引物的过程。
1）由TopoII松弛超螺旋，Dna A、解螺旋酶解开双链，SSB（单链结合蛋白）结合到单链上使其稳定。
2）形成引发体：各种蛋白质因子（dnaB、dnaC）、引物酶（dna G）构成的复合体，负责RNA引物的合成。
引发体沿着模板链3’→5’方向移动引物的合成方向也是5´→3´方向。
27★大肠杆菌起始复制所需蛋白质：p542表19-4 Dna A 在原点处打开双螺旋Dna B 使DNA解旋Dna C 帮助Dna B结合在原点Hu刺激起始引物酶(Dna G) 合成RNA引物SSB 结合单链DNARNA聚合酶促进Dna A活性旋转酶(Topo II) 松驰DNA扭曲张力292、DNA链的延长反应链的延长反应由DNA pol III催化。
在DNA聚合酶催化下，以解开的单链为模板，以四种dNTP为原料，进行聚合作用。
由5´→3´方向延长子链。
303、RNA引物的切除及缺口补齐DNA polⅠ的5，→3，外切酶活力，切除RNA引物。
DNApolⅠ的5， → 3，聚合酶活性，补齐缺口。
4、DNA切口的连接 DNA ligase。
5、DNA合成的终止E.coli复制的终止区含有7个23bp的终止位点 细菌环状DNA，复制叉相遇即终止。
33不连续片段的连接（滞后链）3' 5' 5' 3' RNA 酶（DNA polⅠ） 5' 3' OH P3' 5'dNTP 3' 5'DNA 聚合酶 P 5' 3'ATP 3' 5'DNA 连接酶 5' 3'34原核细胞DNA的 半不连续复制复 制过程复制叉的 移动方向5´3´Topo II Dna A 解螺旋酶 Dna B 引 引物酶+Dna C发 体SSB复制的起始RNA引物DNA链的延长DNA聚 合酶III DNA聚 合酶I3´DNA链终止前导链 滞后链DNA连接酶3´3´5´RNA引物3´5´35★ 复制过程小结：⑴ DNA解螺旋酶……解开双链DNA。
⑵ SSB结合于DNA单链。
⑶ DNA促旋酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来 的扭曲张力。
⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。
⑸ DNA pol III在两条链上合成DNA。
⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。
⑺ DNA ligase连接冈崎片段。
(8)DNA合成的终止36第三节 真核生物DNA的复制P424 1、 复制起点和单位真核生物染色体DNA是多复制子，有多个复制起点， 可以多点起始，分段进行复制。
每个复制子大多在100-200kb之间，比细菌染色体DNA （单复制子）小得多。
37真核细胞DNA复制的特点• 多个起点复制起 点 起 点 起 点 起 点 起 点 起 点真核生物复制叉移动的速度(1~3kb/min)比原核(50kb)的 慢。
38第四节 逆转录逆转录：以RNA为模板，合成DNA的过程 逆转录酶：RNA指导的DNA聚合酶1） RNA指导的DNA聚合酶 2） Rnase H 3） DNA指导的DNA聚合酶逆转录病毒RNA、DNA的合成43第五节DNA突变与修复一、 DNA突变突变 (mutation)：遗传物质结构改变而引起的遗 传信息的改变，也称为DNA损伤 (DNA damage)。
主要分为：碱基置换、DNA片段的缺失或插入、移码突 变、插入失活。
从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改 变。
44突变的类型：p559点突变：DNA原来的一个碱基对被另外一个碱基对所取 代。
转换 ：发生在同型碱基之间的置换。
颠换 ：一种嘌呤与一种嘧啶之间的置换。
移码突变：碱基缺失和插入引起的三联体密码的阅读 方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
45DNA突 变的类型碱基对的置换 (substitution)野生型基因-T-C-T-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-T-G-A-C-A-T-G-C-移码突变 (framesshift mutation)转换-T-C-T-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-C-G-A-C-A-T-G-C-插入-T-C-T-C-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-G-T-G-A-C-A-T-G-C-颠换-T-C-T-T-C-T-G-T-A-C-G-A-G-A-A-G-A-C-A-T-G-C-T缺失46-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-A移码突变：正常5´……GCA GUA CAU GUC……丙缬组缬缺失C5´……GAG UAC AUG UC……谷酪蛋丝47诱变剂：能够提高突变率的物理和化学因子。
碱基类似物(如：5-BrU)碱基修饰剂（羟胺类，NH2OH)嵌入染料：丫啶橙，溴化乙锭紫外线、电离辐射481、光复活细菌光复活现象: 可见光（最有效400nm）可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。
高等哺乳动物没有此酶。
50A 形成嘧啶二聚体B. 光复合酶结合于损伤部位C 酶被可见光激活D. 修复后释放酶2、切除修复P566 图19-27 DNA损伤的切除修复过程在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。
I、结构缺陷的修复：II、碱基缺陷或错配——（N-糖苷酶）523、重组修复P568图19-29重组修复的过程切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。
在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。
54554、SOS反应及其诱导的修复SOS诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。
SOS反应是由RecA蛋白(触发SOS)和LexA阻遏物相互作用引起的。
56。