最新整理组织病理切片以及HE染色讲课稿
病理切片图专业知识讲座培训课件
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病理切片图专业知识讲座
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16号片，慢性肝淤血
16号病片理切，片图专慢业知性识讲肝座 淤血
《病理检验技术》课件——石蜡切片的HE染色
5～10分钟 5～10分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 3～5分钟 1～2分钟 1～2分钟 5～8分钟 2～3秒
石蜡切片的HE染色
11.1%的盐酸乙醇 12.流水冲洗 13.0.5%的伊红水溶液 14.蒸馏水稍洗 15.80%的乙醇 16.95%的乙醇 17.无水乙醇(Ⅰ) 18.无水乙醇(Ⅱ) 19.无水乙醇(Ⅲ) 20.二甲苯(Ⅰ) 21.二甲苯(Ⅱ) 22.中性树胶封片
石蜡切片的HE染色
苏木精
一种天然染料，本身不能染色，氧化后变成苏 木红才成为真正的染料，苏木对细胞核的亲和 力需媒染剂的帮助，此时细胞核呈红色，只有 在碱性环境中，苏木才变成蓝色。
伊红Y
人工合成染料，它可能是通过渗透或弥散作用完 成染色的，故与组织结合不牢固，它对细胞质着 色。
染色原理
石蜡切片的HE染色
2.二甲苯脱蜡后按常规 是用无水乙醇洗去二甲 苯。
4.1%盐酸乙醇分 化液分化时间要 根据分化液的新 旧适当调整。
3.苏木精染液要配好，其好 坏决定染色的优劣。要定期 过滤，避免氧化膜及沉淀等 污染切片。
石蜡切片的HE染色
5.盐酸-乙醇分化后用流水冲洗时间要足够， 目的是把酸彻底冲洗干净，使组织返蓝，也 避免切片残留酸液使切片易褪色。
因此，把第16步的无水乙醇改 为苯酚二甲苯(1:3)混合液进行 脱水，可省去第17步的无水乙 醇，脱水时间3～5分钟，可彻 底脱去切片水分
石蜡切片的HE染色
8.苯酚别名石炭酸，为白色针状结晶，配制苯酚 二甲苯前需要将苯酚放入56℃温箱内或水浴加热 溶解。苯酚如被氧化变成红色，不能使用。
9.使用一些二甲苯代替品如松节油代替二甲苯脱 蜡和透明，可避免二甲苯的毒性，但脱蜡和透明 效果会比二甲苯差，需要增加脱蜡和透明时间。
组织病理切片以及HE染色说课讲解
组织病理切片以及HE染色（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。
（二）实验步骤：一、制作切片1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。
2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。
脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。
组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。
在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。
组织染色后也要进行透明。
最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。
组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。
用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。
为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。
一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56℃。
组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。
这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。
石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。
用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。
但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。
3、切片、制片石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。
切片厚度一般为3-5μm。
切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。
也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。
二、HE染色1. 二甲苯脱蜡2×10 min；2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏水洗1min；7. 伊红染色90s；8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；9. 无水乙醇10min；10.二甲苯2×10 min；11.中性树胶或加拿大树胶封片。
组织切片制作及he染色流程
组织切片制作及he染色流程Title: Organ Section Preparation and HE Staining ProcessTask: To create a document that details the process of organ section preparation and hematoxylin and eosin (HE) staining, with alternating English and Chinese paragraphs.Paragraph 1:The initial step in the organ section preparation process is to fix the tissue.This is done by immersing the tissue in a fixative solution, such as formalin, for a specific period of time.After fixation, the tissue is dehydrated by replacing the fixative with a series of increasing concentrations of alcohol.Dehydration is followed by clearing, where the tissue is immersed in a clearing agent, such as xylene or a xylene substitute.The final step before embedding is infiltration, where the tissue is immersed in a molten embedding medium, such as paraffin wax, until it is fully saturated.切片制作的第一步是固定组织。
病理实验切片 附说明讲课文档
肝硬化 ：肝细胞排列紊乱，形成假小叶，周围有的纤维分割
假小叶 纤维分割
第二十四页，共28页。
急性弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎 ：毛
细血管球增大，细胞数目增多，肾小球囊腔狭窄
肾小管
毛细血管球
肾小球囊腔
第二十五页，共28页。
毒性甲状腺肿：滤泡上皮乳头状增生，可见吸收空泡，淋巴细胞浸
润 淋巴细胞
病理实验切片 附说明
第一页，共28页。
第二页，共28页。
脾梗死
梗死区色淡红，细胞核 均消失，但该处脾组织 的轮廓还存在，梗死区 周围充血出血带不明显。
肝脂肪变：肝细胞浆内大量脂滴空泡,细胞核被推向一侧。
脂滴 空泡
第三页，共28页。
第四页，共28页。
4
第五页，共28页。
纤维瘤
第六页，共28页。
肺结核病：可见结核结节
肺泡
结核结节
第二十页，共28页。
慢性肺气肿：肺泡间隔断裂，肺泡融合
融合的肺泡 肺泡间隔
第二十一页，共28页。
溃疡病 ：可见坏死组织、炎性渗出物合肉芽组织
炎性渗出物及坏 死组织
肉芽组织
第二十二页，共28页。
Байду номын сангаас
第二十三页，共28页。
急性蜂窝织性阑尾 炎
炎性病变呈扇面形由表浅层向深层扩延， 直达肌层及浆膜层。阑尾壁各层皆为大量 中性粒细胞弥漫浸润，并有炎性水肿及纤 维素渗出。阑尾浆膜面为渗出的纤维素和 中性粒细胞组成的薄膜所覆盖
纤维肉瘤
瘤细胞丰富，弥散 排列，与间质无明 显界限。
淋巴结转移性腺癌：淋巴组织内有腺癌组织
淋巴滤泡 腺癌组织
第七页，共28页。
鳞状细胞癌：癌细胞巢状排列，中间有角化珠，间质有淋巴细胞
标准病理组织制片和染色技术讲课文档
5、脱水、透明、浸蜡时间表 大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表
程序
项目
1
75%乙醇
2
85%乙醇
3
95%乙醇
4
95%乙醇
5
无水乙醇
6
无水乙醇
7
无水乙醇
8
二甲苯
9
二ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ苯
10
二甲苯
11
石蜡56－58℃
12
石蜡56－58℃
甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。
O
H
P CONH+HCH+P-CONH P -CON---C----P--CON 肽键 甲醛 H 亚甲基桥
蛋白质分子之进行交换，形成亚甲基桥，把蛋白质分子串 联起来，使蛋白变性，破坏了蛋白质的立体结构，达到固 定目的。
现在二十七页，总共一百一十八页。
四、洗涤
缺点：使组织收缩，变脆。
2、 丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用 于快速脱水
3、 二氧陆环：有毒性，既脱水又透明使组织收缩 小不硬化
4、 正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨 叔丁 醇发松子醇
5、 脱水时间： 根据组织大小、类别、种属、分别安排
现在三十三页，总共一百一十八页。
六、透明(clearing)
标准病理组织制片和染色技术
现在一页，总共一百一十八页。
近年来病理技术不断发展，如特殊染色、组织 化学、免疫组织化学（免疫荧光组织化学、免疫酶 组织化学）细胞培养、原位分子杂交、放射自显影、 原位PCR技术等在广泛的应用和提高，大大促进了 病理学科的发展，把病理学推进了一个新的领域， 但这些新技术也都建立在病理组织制片或染色基础 上，所以要认识制片和染色技术的重要性，不但要 学习新技术，更要掌握这一传统的病理技术，共同 推向病理学科的发展。
组织切片HE染色与免疫组化
1 组织切片1、剪取组织,10 %甲醛固定。
2、已经固定好的组织依次在70 %、80 %、90 %、95 %、95 %、100 %的乙醇溶液中浸泡15-20 min，3、再浸入乙醇和二甲苯（1:1）的混合溶液中15-20 min，然后浸入二甲苯直到透明，将透明的组织浸入石蜡和二甲苯（1:1）的混合溶液中浸泡1 h，用石蜡进行固定。
4、包埋、切片2组织切片HE染色染色结果：细胞核呈蓝色，细胞的细胞质呈粉红色。
步骤：1、组织切片用二甲苯脱蜡15 min，再次用二甲苯进行脱蜡15 min，2、浸入二甲苯和酒精混合溶液（1:1）3 min，依次浸入100%、95 %、90%、80%、70%、50%乙醇各2 min。
3、苏木素染色5 min, 自来水冲洗3 min, 1 %盐酸2 s，自来水冲洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %乙醇2 min,伊红浸泡5 s。
4、 95 %、100 %、100 %乙醇各2 min，最后连续2次二甲苯各15 min，封片。
3 组织切片免疫组化检测1、组织切片置于58 ℃烘箱内烤片20 min, 然后取出待冷却后，进行脱蜡。
2、连续2次二甲苯脱蜡各15 min，依次浸入100 %、95 %、80 %乙醇、蒸馏水各2 min。
3、高压抗原修：将3 L柠檬酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。
切片置于切片架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖高压锅压阀。
当压力锅开始慢慢喷气时（加热5-6 min）计时1-2 min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，蒸馏水冲洗，PBS洗，片子室温冷却20 min，再次PBS洗。
4、免疫组化具体方法参照SP试剂盒（福州迈新）：1、室温，正常非免疫动物血清封闭30 min；2、一抗4 ℃ 12 h；3、用PBS清洗两次，每次2 min；4、室温，内源性过氧化物酶阻断1 h；用PBS清洗三次，每次2 min；5、室温，生物素标记的二抗30 min；用PBS清洗三次，每次2 min；6、室温，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶30 min，7、DAB显色5 min，蒸馏水冲洗；8、Gill’s苏木素复染3 min；9、自来水流水冲洗5 min；依次95 %、100 %的乙醇脱水3 min；10、最后用二甲苯透明，封片，镜检，拍照。
病理切片前处理及HE染色(小鼠肺组织为例)
HE染色（该方法对于肺组织较为适宜）
①新鲜组织取出后4%多聚甲醛固定48小时；
②浸入70%酒精中可保存15天;
③脱水（梯度）：70%乙醇1.5小时1次 80%乙醇30min 1次 95%乙醇
15min 2次 1000%乙醇10min 3次；
④透明：二甲苯透明2次（Ⅰ）、（Ⅱ）各15min（之前是30min）
⑤浸蜡，包埋，烘片程序（56度）
石蜡Ⅰ浸润30min 石蜡Ⅱ浸润90min 石蜡Ⅲ浸润6h（2-4h）包埋
切片烘片
⑥ HE染色
1.脱蜡：二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）各10min；
2水化：无水乙醇5分钟2次 95%乙醇5分钟2次 70%乙醇五分钟1次，自来水轻晃几下置于蒸馏水中3-5分钟（可一直放于蒸馏水中）；
3苏木精染色5分钟---自来水轻晃1分钟至无苏木精-----1%盐酸酒精分化10秒（变为橙红色）---硫酸锂中返蓝（上下来回，可见切片返回蓝色，蒸馏水中静置3秒；
4.脱水：70%酒精20秒----95%酒精5分钟-----无水乙醇10分钟，95%酒精脱水时可以取出切片显微镜下观察染色效果）；
5透明：二甲苯透明5分钟2次；
6.封片：中性树胶，在二甲苯中取出切片趁二甲苯未干时封片，通风厨中进行后置于通风厨中晾干。
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组织病理切片以及HE染色
（一）实验原理：苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）能较好地显示组织结构和细胞形态，可用于观察、描述正常和病变组织的形态学，而且HE切片可较长时间保存，被称为常规染色方法。
（二）实验步骤：
一、制作切片
1、取材、固定：取小鼠肾脏组织适当大小，并且放入盛有固定液的小瓶中保存。
2、组织的脱水、透明、浸蜡与包埋
组织固定后还需经过脱水、透明、浸蜡等过程才能制成蜡块，进行石蜡切片。
脱水是指用某些溶媒置换组织内水分的过程。
组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，使石蜡浸入组织块。
在此过程中，因组织块中的水分被溶剂所取代，组织块变得透亮，因此称之为透明。
组织染色后也要进行透明。
最常用的透明剂为二甲苯，处理时间为30min左右。
组织经透明后在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡。
用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡和明胶等）渗入组织内部的过程称为浸透或透入。
为使石蜡充分渗入组织块中，常需经过3小时的浸渍，期间需更换3次石蜡。
一般用于浸蜡的石蜡熔
点为52-56℃。
组织块经过浸蜡或浸透，用包埋剂（石蜡、火棉胶、碳蜡和树脂等）包起的过程称包埋，包埋后便制成含组织的块。
这种包埋块可使组织达到一定的硬度和韧度，有利于切成薄片。
石蜡包埋是病理日常工作中最常用的包埋方法。
用于包埋的石蜡熔点一般为60℃左右。
但在有些情况下，如某些酶染色时，则需采用低温石蜡包埋，以保存组织内酶的活性。
3、切片、制片
石蜡切片常用的切片机有轮转式切片机和平推式切片机，以前者为多用。
切片厚度一般为3-5μm。
切片时先将组织片平摊于一块玻璃上，迅速滴加30％的酒精水溶液使组织片完全展开，再移入40℃恒温热水器中。
也可直接将组织切片移入40℃的恒温热水器中，待组织片完全展开后将其贴附于载玻片上，经56-60℃烤片30-60min后即可进行染色。
二、HE染色
1. 二甲苯脱蜡2×10 min；
2. 无水乙醇洗去二甲苯2×5min；
3. 95％、80％乙醇各l0 min，自来水洗l min（不要让急水直接冲至载玻片上的组织），蒸馏水洗1min；
4. 苏木素染色4 min，自来水洗2 min；
5. 1％盐酸酒精分化20 s（镜下控制），自来水洗2 min；
6. 1％稀氨水返蓝30s（镜下控制），自来水洗2分钟，蒸馏
水洗1min；
7. 伊红染色90s；
8. 80％乙醇脱水10s，95％酒精10s，无水乙醇5min；
9. 无水乙醇10min；
10.二甲苯2×10 min；
11.中性树胶或加拿大树胶封片。
（三）实验结果：细胞核呈蓝色；细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。
钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。
（四）实验分析：HE染色时病理学中常用的一种诊断方法，通常将病理切片染色后再在显微镜下观察组织的病理学变化，从而做出病理学诊断。