人体胚胎干细胞
什么是胚胎干细胞
什么是胚胎干细胞胚胎干细胞是在人胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。
囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。
中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。
内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。
每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。
如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。
由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。
当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。
研究证实：分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化成各种细胞，包括神经细胞，造血干细胞（血细胞的前体）和心肌细胞。
令人惊奇的是，这些细胞还具有自发发育成某些原始结构的趋势。
如在一定的培养条件下，一部分胚胎干细胞会分化为胚状体（与小的跳动的心脏具有奇异的相似之处），而另一些细胞会发育成包含造血干细胞的卵黄囊。
形成胚状体和卵黄囊的比例可通过改变培养基而改变，但至今还没有诱导胚胎干细胞发育为一纯的分化细胞群的报道。
从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。
不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。
但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。
这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent），而不是全能的（totipotent）。
尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。
这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。
胚胎干细胞研究的现状与前景
胚胎干细胞研究的现状与前景胚胎干细胞可以分化成人体的各种组织和器官，因此一直是医学研究的热点之一。
但是，由于涉及到胚胎的生命伦理问题，使得该领域的发展遇到了很多挑战和阻碍。
本文将分析胚胎干细胞研究的现状和前景，同时探讨胚胎干细胞所能带来的医学和科学意义。
胚胎干细胞的来源胚胎干细胞最初是从早期人类胚胎中获得的，它们具有很强的自我更新能力和分化潜能，可以进一步分化成不同类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞等等。
然而，由于胚胎干细胞的采集必须摧毁早期胚胎，对于胚胎干细胞的使用，存在严重的道德和伦理问题。
因此，与此同时，科学家也在寻求其他替代突破性的治疗和研究方法。
目前，科学家已经通过多种渠道获取到胚胎干细胞。
一种常见的方法是使用超过了胚胎发育初期就死亡的胚胎，它们通常来自于体外受精或植入宫腔的过程中出现的发育异常。
另外，通过基因编辑技术，科学家也能够改变普通细胞的基因组，使其成为胚胎干细胞。
这些方法使得胚胎干细胞的获取更加便捷和合法，但是相关伦理问题依然存在。
胚胎干细胞的研究进展在以胚胎干细胞为研究对象的过程中，科学家已经取得了一些令人兴奋的进展。
其中最为显著的是胚胎干细胞的定向分化，这种分化可以让胚胎干细胞真正地变成任意一种身体细胞。
例如，在实验室里，科学家已经成功地将胚胎干细胞分化成为心肌细胞、神经元和血液细胞等各种类型的细胞。
这种胚胎干细胞的分化能力，引发了人们对于干细胞的热情。
这些不同类型的细胞可以用于治疗许多疾病，如糖尿病、心血管疾病、阿尔茨海默病等等。
此外，胚胎干细胞还可以用于疾病的研究，这不仅有助于探索疾病发生机制，更有助于开发新的药物治疗手段。
胚胎干细胞的应用前景胚胎干细胞的应用前景非常广阔，它可以改善许多重要疾病的治疗方式。
例如，它可以为因器官功能衰竭而需要移植的患者提供新的治疗方法。
实际上，胚胎干细胞已经被用于治疗严重的神经系统疾病，如帕金森综合征、脑积水和脊髓损伤等等。
此外，胚胎干细胞也可以用于修复其他器官，如心脏、肝脏和胰腺等等。
人体胚胎干细胞的研究现状与发展前景
人体胚胎干细胞的研究现状与发展前景一、胚胎干细胞概述胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ESC）是源于早期胚胎的一种细胞类型，具有无限制的自我更新和多向分化能力，能够分化为三胚层中所有细胞类型。
因此人体胚胎干细胞被认为是一种广泛应用于医学领域的细胞类型。
目前，人类ESCs主要来源于已停止生长的胚胎（IVF胚胎），但由于其来源具有争议性，限制了其在伦理和法律方面的广泛使用。
二、研究现状A.ESCs的研究历程1.1998年，美国的一组科学家最早从人类胚胎中培养出胚胎干细胞。
2.1999年，英国帝国癌症研究中心的James Thomson和他的团队，首次从人类胚胎中分离出人类胚胎干细胞，并建立了人类胚胎干细胞线。
3.2006年，Shinya Yamanaka等人通过若干基因的转化和重编程，首次制备出人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。
这种方法不再需要侵犯胚胎捐赠者的权益，而且能够根据患者的特点制造出个性化的胚胎干细胞线，是当前ESCs研究领域中备受关注的热点研究方向。
B.ESCs的分化研究目前，人体胚胎干细胞的分化研究主要集中于四个方面：神经、心脏、肝脏和胰腺。
1.神经元的分化神经元是神经系统的基本单位，它的从胚胎干细胞分化出的方法非常复杂。
神经发生主要分为神经前体细胞生成、神经元生成和神经元定向运动三个阶段。
目前，国内外许多研究机构都对人体ESCs分化成神经元方面进行了大量研究，并取得了不俗的实验结果。
2018年，著名的斯坦福大学西雅图神经科学研究所发现，钙离子信号途径是调控人体ESCs分化成神经元去向的关键因素。
2.心肌细胞的分化心肌细胞作为心脏的重要组分，分化出的方法也较为复杂。
研究表明，与神经元分化相似，心肌细胞分化早期也需要内外环境信息作为促进剂。
科学家已经发现了一种名为“smoothened”（SMO）的蛋白质，这种蛋白质可以控制体内信号传递的多个途径，从而影响分化成心肌细胞的概率。
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性
胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性随着科技的发展，再生医学成为了一个备受关注的领域，其中胚胎干细胞作为再生医学的“明星”，备受关注。
但是，对于跨越正常生理的应用还存在伦理道德问题，以及一些局限性。
本文将探讨胚胎干细胞在再生医学中的应用及其局限性。
一、胚胎干细胞的定义与特点胚胎干细胞指来源于早期胚胎的一类具有自我复制和分化潜能的干细胞，可以区分为内胚层干细胞和外胚层干细胞。
胚胎干细胞具有以下特点：①自我更新②可分化成不同细胞类型③可以体外繁殖因此，胚胎干细胞可用于再生医学和基础研究。
二、胚胎干细胞在再生医学中的应用1. 代替病变细胞胚胎干细胞可以通过体外培养形成各种组织和器官细胞，如心脏细胞、神经元细胞、肝细胞等。
因此，如果人体某个部位的细胞暴露于病变或正常衰老的威胁，那么胚胎干细胞可以用于替代这些病变的细胞，从而治疗许多疾病，如心脏病、糖尿病、帕金森病等。
2. 治疗疾病胚胎干细胞可以用于治疗许多不可治愈的疾病，如心脏病、糖尿病、癌症等。
利用胚胎干细胞治疗疾病的方法是，将干细胞注射到病人的体内，让其分化成需要的细胞类型从而修复破损组织。
三、胚胎干细胞的局限性1. 伦理、道德问题人类胚胎的获得是胚胎干细胞应用的基础。
因此，胚胎干细胞的研究与使用在伦理和道德方面引起了争议和质疑。
对于胚胎干细胞的使用可能侵犯被使用的这些胚胎的尊严和权利。
如果利用胚胎干细胞进行研究和应用，需要在相应的法律与伦理规范、社会共识以及利益平衡的基础上来进行。
2. 值得注意的潜在风险在应用胚胎干细胞过程中的潜在的风险包括，潜在的细胞突变风险、组织排异反应、T细胞和自身免疫细胞的反应等。
此外，由于胚胎干细胞具有无限制自我复制的能力，其对人体的潜在恶性肿瘤形成风险也需要被考虑到。
3. 模式性问题胚胎干细胞只可以形成特定的细胞类型，并不适合于所有的修复需求。
此外，由于体内的生产环境具有的多样性，使用胚胎干细胞时存在与体内环境之间的差距，这也会影响再生医学的实用性。
【高中说明文阅读】《人体干细胞》阅读答案
【高中说明文阅读】《人体干细胞》阅读答案人体干细胞人类胚胎干细胞是人类胚胎发育早期囊胚中未分化的细胞。
囊胚外表是一层扁平细胞，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等；中心的腔称为囊胚腔，腔内侧有内细胞群。
内细胞人体干细胞人类胚胎干细胞是人类胚胎发育早期——囊胚中未分化的细胞。
囊胚外表是一层扁平细胞，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等；中心的腔称为囊胚腔，腔内侧有内细胞群。
内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化，内胚层分化形成肝、肺和肠等，中胚层分化形成骨胳、血液和肌肉等，外胚层分化形成皮肤、眼睛和神经系统等。
由于内细胞群能发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。
成人身上也存有干细胞，主要原产于骨髓、血液、大脑、胰腺等处，比如说骨髓和血液中就存有输血干细胞。
但是，这些成干细胞非常叶唇柱，较难拆分和提纯。
它们的促进作用基本上就是确认的，比如骨髓中的输血干细胞在体内环境下的历史使命就是分化成各种血液细胞。
虽然近来辨认出成干细胞也具备一定的可塑性，比如在体外培育时，可以通过发生改变条件使骨髓干细胞分化成神经细胞，但是目前还未辨认出成干细胞能够像是胚胎干细胞那样具备分化出来所有类型细胞的能力。
同时，成干细胞在体外扩充超过三四百代。
因此生物学家们普遍认为胚胎干细胞的研究更有价值，美国生物学家戴利说道：“20世纪是药物治疗的时代，21世纪则就是细胞治疗的时代。
”目前，胚胎干细胞研究丛一个重点是用来产生神经细胞，以修复受损伤的神经系统。
美国霍普金斯大学一个实验室用病毒感染老鼠的脊髓神经，使之瘫痪，然后从人的胚胎组织分离出来干细胞，在体外培养一段时间后，再注射到瘫痪老鼠的脊髓中。
三个月后经过治疗的老鼠能蹒跚走路，而未经治疗的老鼠依然故我。
解剖结果显示，这些来自人类胚胎的干细胞已经布满了老鼠的脊髓，并具有成熟的神经细胞的特征。
胚胎干细胞另一个研究重点就是用作产生能分泌胰岛素的胰腺非政府，再将这些胰腺非政府安远植到体内，以根治糖尿病。
人类胚胎干细胞的分化与发展
人类胚胎干细胞的分化与发展人类胚胎干细胞是一种具有完全分化能力的细胞，可以分化成人体内任何细胞类型，包括肌肉细胞、神经细胞、心肌细胞等。
这种细胞可以用于治疗许多疾病，如糖尿病、帕金森病、心血管疾病等。
在许多国家，这项技术已经获得了许可，并得到了广泛的应用。
人类胚胎干细胞的分化和发展是一个复杂的过程，需要许多因素的协同作用。
下面我们将对这个过程进行分析和探讨。
胚胎发育的基本原理胚胎是指从受精卵形成以及在早期发育阶段的胚胎到产生新个体的所有生物阶段。
发育是一个从单细胞到成体的过程，包括细胞增殖、分化、迁移等环节。
在早期发育阶段，胚胎由一系列发育过程组成，包括受精、分裂、囊胚阶段、胚胎期和胎儿期。
整个胚胎发育过程由一组由生物学家发现的信号分子组成，这些信号分子被称为发育促进因子。
人类发育出胚胎膜、胚盘和胎盘三个基本结构。
胚胎膜是指在受精后，胚胎通过分裂的过程，所形成的一些细胞，可转化为化膜使形成的一些组织，即为胚胎膜。
成熟的胚胎膜进一步发育，根据内胚层、外胚层和外部胚盘的扩展演变，形成胚体。
底层细胞会分裂成为细胞心肌和比心肌，然后经过各种化学反应，最终形成一个完整的胚体。
不同基因对发育的影响胚胎发育和不同基因的表达数量有关，比如CDX2、OCT4和SOX2等基因在分化的过程中扮演着非常重要的角色。
这些基因分别影响胚胎细胞凋亡（程序性细胞死亡）、细胞增殖和制约性细胞分化（限制细胞分化的机制）等过程。
OCT4和SOX2基因的表达以及它们之间的相互作用，能够将内胚层的细胞保持在一个未分化状态，同时降低外胚层和基质组织的分化程度，维持胚层形态的稳定性。
而CDX2基因则指导外胚层细胞向基质组织分化并最终形成胎盘。
这些基因对于维持胚层稳定性和分化特征至关重要。
干细胞的发现过程干细胞广泛存在于人体内的多个组织中，胚胎干细胞在发现后，在干细胞研究的领域占据了重要地位。
早在1981年，美国国立卫生研究院的研究人员James Thomson博士从初级的胚胎样本中获取了胚胎干细胞。
胚胎干细胞的研究和应用
胚胎干细胞的研究和应用胚胎干细胞是一种多潜能性的细胞，可以通过分化形成人体的各种组织和器官。
这种细胞在医学领域有着广阔的应用前景，但同时也存在着伦理和道德方面的争议。
本文将从胚胎干细胞的定义、来源、研究现状和应用等多个方面进行探讨。
一、胚胎干细胞的定义和来源胚胎干细胞是一种内部细胞团细胞，位于囊胚内部，具有多潜能性和自我更新能力。
由于其具有这些特殊的性质，胚胎干细胞被广泛运用于生物学、医学、药物研究等领域。
胚胎干细胞的来源主要是在体外受精后的早期胚胎细胞，但也可以来自人类胚胎手术中取出的胚胎内细胞团。
无论来源如何，胚胎干细胞都需要在适当的条件下进行培养，以维持其干细胞状态。
二、胚胎干细胞的研究现状胚胎干细胞的研究是一项极具挑战性的任务。
由于其独特的性质和高度复杂的胚胎发育过程，目前关于胚胎干细胞的研究仍处于初级阶段，但也已经取得了一些显著的成果。
现阶段，胚胎干细胞的研究主要集中在以下几个方面：首先是储存和维持胚胎干细胞状态的技术；其次是探索胚胎干细胞的分化规律和遗传调控机制；还有就是开发胚胎干细胞的临床应用。
目前已经有很多关于胚胎干细胞分化方向的研究，而分化过程中的表观遗传学调控机制也得到了人们越来越多的关注。
除此之外，诸如人工合成生命、3D生物打印等理念性和技术性难题的突破也进一步推动了胚胎干细胞的研究发展。
三、胚胎干细胞的应用前景由于胚胎干细胞的多潜能性和细胞自我更新能力，它们被广泛应用于医学领域。
例如，利用胚胎干细胞技术可以实现细胞治疗、组织工程和干细胞移植等方面的临床应用。
在细胞治疗方面，胚胎干细胞可以治疗许多血液和骨骼疾病。
干细胞移植可以用于治疗糖尿病、肝病、关节炎、失智症和白癜风等多种疾病。
组织工程则是利用胚胎干细胞培育出功能性的心脏、肝脏等组织，可用于在临床上替代已经受损的组织。
虽然胚胎干细胞的研究和应用仍面临着一些伦理和道德方面的争议，但随着科技的不断发展，人们越来越重视胚胎干细胞作为一种重要的医学资源。
胚胎干细胞的应用前景和限制
胚胎干细胞的应用前景和限制胚胎干细胞是人类体内最基本的细胞类型之一，它们具有卓越的再生和分化能力，可以分化为所有细胞类型，也就是说，它们可以从一个单细胞分化为各种组织和器官。
这使得胚胎干细胞成为了医学研究和治疗中的重要技术和资源。
然而，虽然胚胎干细胞在医学方面的潜力很大，但是它们的应用仍然面临着许多限制和挑战。
一、胚胎干细胞的应用前景1. 治疗疾病从理论上说，胚胎干细胞可以分化成所有器官和组织，这意味着它们可以用于治疗很多疾病。
最被广泛研究的应用领域是变态反应和自身免疫性疾病，如糖尿病、心肌梗塞、帕金森氏病等。
目前，在小鼠和猴子模型中，胚胎干细胞已经成功应用于组织再生，而在人体内的试验仍在持续中。
2. 人体器官的再生除了治疗疾病，胚胎干细胞还可以被用于促进人体器官的再生。
例如，它们可以用于修复心脏和肝脏组织，并且还可以分化成脑细胞和神经元等细胞。
胚胎干细胞的这种特性可以用于治疗继发性器官疾病，例如失明和耳聋等疾病。
3. 进化学和毒理学硏究胚胎干细胞不仅可以用于治疗疾病和再生器官，同时也可以用于硏究多种生物学、进化学和毒理学方面的问题。
例如，胚胎干细胞可以用于研究基因表达和遗传变异在人类进化中的作用。
二、胚胎干细胞的限制和挑战1. 宗教信仰和道德问题胚胎干细胞的来源是一个待产的胚胎，这引发了一系列的宗教信仰和道德问题。
因为许多宗教都认为胚胎是一个有生命的存在，在某些情况下，使用胚胎的干细胞可以被视为是对这种存在的侵犯。
然而，也有许多科学家和哲学家认为，科学的进步和医学的发展是重要的，并且使用胚胎干细胞来治疗疾病是一个有道德的问题。
2. 细胞学和遗传学问题细胞学和遗传学问题是使用胚胎干细胞的一个关键问题。
由于胚胎干细胞可以分化为任何类型的细胞，因此使用胚胎干细胞可能会导致细胞和胚胎的不同象征体被混淆，这可能会导致一系列的遗传学问题。
此外，由于胚胎干细胞可以分化为任何类型的细胞，也有可能产生不良细胞的副作用，例如癌症等病症。
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微滴培养板：在塑料培养皿中用受精液做成20-40 μL的微滴，上覆蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵
母细胞10-20枚及获能处理的精子 (1.0-1.5)×109L-1
，在培养箱中孵育6-24 h。
胚胎质量评价标准
Ⅰ级胚胎：胚胎卵裂球均匀规则,胞质均匀透明,透明带完整,
胚胎无或仅有极少(<10%)的碎片。
第五课 人胚胎与胚胎干细胞的培养
引言
自1998年Thomson实验室建立首株人ES细胞系以来,全世 界范围内已经相继建立1200多株不同的人ES细胞系。然而, 研究者们仍致力于建立新的人胚胎干细胞系,尤其是HLA配型 及各种族人群的。
很多声称衍生出的人ES细胞并没有严格的特征描述和评估
。列于NIH干细胞注册协会中的只有21株有证实的特征描述
胰酶分散传代
在hES克隆较多时，可采用胰酶（0.05%胰酶/EDTA) 进行传代。
最安全的方法是选择6孔板中形态良好的亚克隆，机 械法挑取50-100个克隆，转移到新孔备份；同时剔 除已分化克隆；在原孔中加入胰酶消化，然后转移 到同样直径的新孔；5-7天后可进行下一次传代。
第二次使用胰酶消化时，可以1:3传代。
hES细胞的标志物的检测
免疫细胞化学分析，综合它提供的有关细胞形态和 抗原位置等信息，检测未分化hES标志物的表达情况。 表面标志物的流式细胞检测，流式细胞能够提供培 养物中表达干细胞标志物的细胞数以及其染色强度 的信息，多种抗体和检测通道，可以同时获得多个 标志物的信息。 定量RT-PCR检测，在缺乏相应特异性抗体时可以检 测相关基因表达的替代方式。
三、hESCs细胞系的特征描述
hES细胞形态的一般特征
目前使用的有饲养层和无饲养层方案都会产生混合 细胞群，其中包含因自发性分化而出现的多种形态 细胞。
典型的未分化的hES细胞，通过细胞与细胞之间的 缝隙连接而形成“紧密”的克隆，克隆中细胞核仁 明显，核/质比例高。
长期培养后（＞50代），未分化克隆相互接触， 可以在低倍镜下看到相对均匀的薄层。
人受精卵到囊胚的发育过程（0-5d）
A 两细胞胚胎 B 8细胞胚胎 C 紧束化囊胚 D 扩张的囊胚
人囊胚的各种形态
早期囊胚 腔化囊胚
扩张囊胚
孵化囊胚
内细胞团的各种形态
A 由紧密紧束的多个细胞组成 B由若干细胞构成，细胞不紧束 C 少量细胞 D没有真正的ICM
滋养层细胞的各种形态
E具有完整的、黏附上皮形成的单细胞层 F 单细胞层不完整，有线性区域 G 仅少量大细胞 H仅有退行性变的细胞
制备用于共培养的子宫内膜培养物
通过导管获得子宫内膜活检组织，剪碎，0.1%胶原酶消化1h 。静置，去掉上清，用DMEM重悬沉淀并洗涤3次。
含1%人血清白蛋白HSA的DMEM重悬细胞团、培养瓶中孵 育15分钟。将上清转移至新培养瓶，并加入3ml 1% HSA的 DMEM孵育15分钟。
再次收集所有上清放置于试管中，确定总体积。
5.0%CO2、37 ℃培养箱中继续培养4-9 h。
胚胎体外培养常用方法
悬滴培养法(盖玻片或凹载片)
旋转管培养法(管状培养器皿) 灌注小室培养法(两个盖玻片或金属圈) 培养瓶培养法 培养板培养法
培养板培养法
四孔培养板：在每孔加入500 μL受精液和100-150 枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子 (1.0-1.5)×109L-1，在培养箱中孵育6-24 h。
早期hES细胞的冻存—玻璃化法
早期细胞克隆尤其珍贵，需要及时冻存。但
由于细胞数目较少，传统慢速冷冻-快速复温
方法不太适用。
原理：通过逐步增加蔗糖和DMSO冷冻液的
浓度来保护细胞，减少细胞内的冰晶形成。
玻璃化法冻存步骤
按照传代大小2倍 体积切割细胞团块
hES-HEPSE 培养基1ml hES-HEPSE培 养基+10%乙二 醇+10%DMSO hES-HEPSE培 养基+ 25%1M蔗糖溶液 +20%乙二醇 +20%DMSO
试剂：尽量使用已有的hES细胞系的常规培养
物进行测试。
饲养层：和小鼠ES细胞制备一样，使用新鲜
制备，代数较低的小鼠MEF细胞。
内细胞团的分离
将新鲜获得或冻存-复苏的人类胚胎在序贯培养基中
培养至囊胚阶段。采用酸性Tyrodes溶液孵育溶解
透明带。
可采用免疫外科学方法、显微外科学方法、组织培
养法等方法在饲养层细胞上得到内细胞团衍生的细
序贯培养
研究表明：胚胎培养的不同阶段，对营养需求不同。
序贯培养基由两种不同的培养基构成。第一种培养
基用于支持受精卵到8细胞期的发育，含相对高浓度
的丙酮酸盐、乳酸盐和相对较低的葡萄糖；第二种用
以协助8细胞期到囊胚期的发育，含相对高浓度的葡
萄糖和相对较低的丙酮酸盐、乳酸盐。
共培养方案
虽然胚胎培养基有了很大的发展，但体外发育的总 体情况仍然落后于体内发育。 可以使用多种细胞包括输卵管、子宫内膜、卵丘细 胞、颗粒细胞等和胚胎共同培养的方案加以改进。 优点：参与共培养的细胞能够分泌胚胎营养因子、 生长因子和细胞因子等，以及消除潜在的有害物质 （重金属、铵和自由基等），降低培养基中的毒物 。
未分化hES细胞的核型分析
某些维持培养在有饲养层和无饲养层条件下的 hESC培养物出现了异常核型，所以应该常规进行 核型分析 (Karyotype Analysis)。 hESCs的核型分析步骤和方法与一般体细胞或小 鼠ESCs基本一致
酶活检测
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP) 活性 检测广泛用于确定细胞是否处于未分化状态 的标志之一。
宫内膜上皮细胞的24孔培养板上共培养。培养基IVF
：CCM (coculture media)=1：1
3d 评估胚胎发育状态，使用CCM培养基
5-6d 对胚胎进行形态学分类。
二、人胚胎干细胞的 衍化生成和维持培养
建立hES细胞系的流程
衍化hES细胞系的准备工作
仪器：显微镜、培养箱、超净台 比一般细胞培养更严格的无菌环境。
将700-800μl的子宫内膜上皮培养基和200-300 μl带有细胞的
上清混合加入培养孔。
培养4-6天至铺满，即可用于胚胎的共培养。
子宫内膜上皮细胞培养物
A 0d；B 细胞增殖 C 4-6d形成单层
共培养流程
0-1d 分离卵母细胞，确定受精，使用IVF培养基
2d 评估胚胎是否处于卵裂期，将胚胎放置于铺满子
，可以用于广泛的学术交流。
内容提要
人胚胎培养
人胚胎干细胞的衍化生成与维持培养 人胚胎干细胞的特征描述
hESC建系使用的胚胎来源
体外受精IVF或单精注射等辅助生殖技术中的剩余胚胎,经患 者知情同意后，可以用于科研，建立hESCs
患者已成功妊娠或由于其它原因而放弃的新鲜或冻存胚胎。
一些评分较低，不适于移植的胚胎。
，以维持同源整倍体细胞群的稳定。
衍化生成携带特定基因缺陷的 hES细胞系
植入前基因诊断PGD是为携带遗传病的夫妇设计的诊断检
查，用以确保植入健康的胚胎。需要将胚胎在体外培养至6-
8细胞期，取出其中的1-2个用于PCR或荧光原位杂交试验
。
来自PGD的胚胎可以发育至囊胚阶段，目前已有5个hES细 胞系是从PGD剔除的囊胚衍化而来，具备hES的全部特征 ，在分化后可以用做疾病模型加以研究。
hES具有高端粒酶活力，与其长期的增殖能 力以及表达hTERT的特征向吻合。可以通过 端粒重复扩增方案TRAP检测端粒酶活力。
未分化hES细胞的标志物
针对细胞表面抗原的标志物，如阶段特异性胚 胎抗原SSEA-3和SSEA-4，蛋白聚糖抗原的 TRA-1-60和TRA-1-81等。
多能性的分子标志物，如Oct3/4、Sox2、 Nanog、UTF-1等。
最好hES的接种密度 高质量的hES克隆的外观
Morphology of a hESCs colony cultured in different culture conditions. (A) With MEFs, (B) with foreskin fibroblast, and (C) in animal-, serum- and feeder layer-free conditions.
hES-HEPSE 培养基1ml 5分钟
hES的冻存和复苏
hESCs长期培养导致的核型变异问题
hES细胞的未来应用，无论是科学研究还是临床治疗，都要
求保持稳定的核型。
尽管有些hES细胞系培养到107代时仍然能保持正常核型， 但随机的核型变异仍然可能发生。
目前已有几篇报导发现连续培养导致细胞核型异常。这可能 是由于培养物中原有一个异常核型的亚细胞群在培养过程中 获得了生长优势。因此，有必要将培养hES细胞定期克隆化
经验表明，高质量的胚胎衍化效率更高，因此最佳的人胚胎
培养体系就成为所有衍化实验室工作效率的关键。
受精卵制备
取卵后三四小时，将精子和卵子放在一起进行体 外受精或进行单精子卵细胞浆内注射。
从培养箱中取出卵子预培养皿和已调整好精子密
度的精子制备液，按照(3-5)×104个精子/每个卵
子的比例加入精子，将受精培养皿放回体积分数
60s 液氮 保存
10%玻璃化 溶液1ml