酿酒酵母细胞GUT2基因的研究进展_秦萌

酿酒酵母细胞GUT2基因的研究进展秦 萌，徐 敏，刘倩楠，周立娜，房 月(中国医科大学药学院 微生物与生化药学教研室，辽宁 沈阳 110001)摘要:目的 一磷酸甘油脱氢酶(glycerol-1-phosphate dehydrogenase，GPD)是广泛存在于微生物、动物和植物中的一类重要代谢酶，参与能量代谢、磷酸合成等生物过程。

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞中存在3种GPD的同工酶，其中有两种以NAD为辅基并定位于胞质中，分别由GPD1和GPD2基因编码形成；还有一种GPD同工酶以FAD为辅基，由GUT2基因编码形成，定位于线粒体，参与细胞的甘油代谢[1]。

GUT2基因是酿酒酵母细胞中线粒体FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因。

在甘油分解代谢中，该酶催化3-磷酸甘油转化成为磷酸二羟丙酮。

同时还发现，GUT2基因是一个全新的线粒体内膜肽酶IMP的酶作用物。

在工业生产中，通过敲除GUT2基因构建高产菌株可用于提高甘油产量。

本文从GUT2基因的生物学功能研究与工业生产应用展开论述。

关键词:GUT2；酿酒酵母；线粒体内膜肽酶中图分类号:R329.2+6 文献标识码:A1 GUT2基因的生物学功能1.1 GUT2基因与甘油代谢 在酿酒酵母细胞中，存在着如下两条甘油分解的代谢途径[2]。

第一条主要途径是:在胞质中甘油先经由GUT1基因编码的甘油激酶催化生成 3-磷酸甘油，后者再经线粒体由GUT2基因编码的FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶催化生成磷酸二羟丙酮(Dihydroxyacetone-P，DHAP)，最后DHAP再转化为3-磷酸甘油醛，参与能量代谢[2]。

GUT1基因与GUT2基因编码调节的蛋白质在细胞中的位置不同，所发挥的生物学功能也不同。

经过对酿酒酵母细胞甘油代谢途径的研究发现，在以甘油为碳源的培养基上缺失GUT2基因的菌株不能生长，这为甘油工业生产提供了一定的理论基础[3]。

在酿酒酵母细胞中，还存在着另一条分解甘油的途径。

在该代谢途径中，甘油先经过由GCY1与 YPR1 基因编码的NADP+-甘油脱氢酶催化生成二羟丙酮，后者在DAK1和DAK2基因编码的二羟丙酮激酶的参与下生成DHAP，继而进入糖酵解途径[4]。

由于缺失GUT1/GUT2基因的菌株在以甘油为唯一碳源的情况下不能进行生长代谢，因此尚不清楚这条分解代谢途径在酵母细胞中发挥怎样具体的生理功能。

1.2 GUT2基因与3-磷酸甘油穿梭反应 在酿酒酵母生长过程中，大量NADH在胞内产生。

无氧代谢条件下，酵母细胞氧化NADH的唯一途径是产生甘油；在有氧条件下，有两大主要机制可将胞内的NADH转运到线粒体电子传递链中，即线粒体外的NADH脱氢反应和3-磷酸甘油穿梭反应(Glycerol-3P，G3P shuttle)，前者即Nde1p和Nde2p催化的NADH脱氢反应[5-6]。

在酵母细胞较低的比生长速率下，这两大机制均能够维持细胞的呼吸生长[5]。

G3P shuttle反应涉及到依赖FAD的Gut2p和辅因子Gpd1p。

Gut2p存在于线粒体内膜上，其催化位点指向细胞质，是维持胞内氧化还原平衡的主要因素之一[7]。

G3P shuttle反应过程如下:在胞浆NAD+-3-磷酸甘油脱氢酶的催化下，首先NADH使DHAP还原为3-磷酸甘油，然后3-磷酸甘油被线粒体FAD+-3-磷酸甘油脱氢酶再氧化为DHAP。

在这个反应系统之中，当NADH催化DHAP转化为3-磷酸甘油时，NADH也被3-磷酸甘油脱氢酶即Gpd1p转化为NAD+，接着3-磷酸甘油由Gut2p将其电子传递到呼吸链中，参与能量代谢[8-9]。

在不同条件下，这两大机制的重要性各有所不同[8]。

在高浓度葡萄糖有氧生长的情况中，G3P shuttle失活，呼吸作用部分受抑制，原因是GUT2基因受到葡萄糖的阻遏作用，这种阻遏效应作用在转录水平，表现为Gut2p受高葡萄糖浓度抑制。

在低浓度葡萄糖有氧生长的情况下，NADH脱氢酶和G3P shuttle同时作用，其中NADH脱氢酶发挥更加重要的作用，表现为在低浓度葡萄糖中，缺失Nde1p/Nde2p的菌株比缺失Gut2p的菌株受到的影响更为严重[10]。

另外有研究表明，低流量NADH形成时，G3P shuttle足够维持细胞内的氧化还原平衡，而当NADH代谢流高于某一特定值时，线粒体外的NADH脱氢反应就变得非常必要。

因此G3P shuttle真正起作用是在酵母细胞低生长率的情况下，甚至是饥饿状态[11-12]。

G3P shuttle中，Gut2p活性受到ATP/ADP和NADH脱氢酶激活作用的抑制。

Gut2p对ATP的抑制敏感，即在非常低的ATP浓度下，Gut2p大部分的活性仍被抑制[13]。

GUT2基因的表达受到碳源的调控，当细胞在葡萄糖等发酵性碳源上培养时转录被抑制，而在甘油或乙醇等非发酵性碳源上培养时转录被诱导。

但无论是利用哪种碳源，GUT2基因的缺失导致的G3P shuttle功能丧失都不会引起酿酒酵母细胞的生长缺陷[14]。

1.3 GUT2基因作为一个全新的线粒体内膜肽酶作用物被发现1.3.1 线粒体内膜肽酶IMP的基本认知 线粒体在细胞的生命活动中有着非常重要的作用，不仅为细胞代谢提供能量，还参与细胞周期的调控、细胞凋亡等生命活动。

这些生物功能由线粒体中的蛋白质来执行，其中绝大部分蛋白质都是经过细胞核编码，再在核糖体上合成后运输到线粒体的各个部位。

线粒体是通过一套完备的蛋白质转运系统来转运线粒体前体蛋白质的[15]。

线粒体具有外膜、内膜、膜间隙、基质4个功能区隔，进入不同部位的蛋白质转运途径也不同[16]。

线粒体的前体蛋白定位分选信号分为可剪切的前导序列和非剪切的多种整合定位信号两类[16]。

前导序列存在于线粒体前体蛋白的N端，含有10~80个氨基酸残基，能将蛋白质定位到线粒体基质中[17]。

此外前导序列之后还有一段疏水分选信号，它决定了前体蛋白在内膜或膜间隙中的定位。

对于内膜蛋白，其分选信号是成熟蛋白的一部分并可辅助前体蛋白定位于线粒体内膜上；对于膜间隙蛋白，其分选信号可被在内膜外侧的线粒体内膜肽酶(inner membrane peptidase，IMP)所剪切，所形成的成熟蛋白被释放至线粒体膜间隙中[17-18]。

除了IMP，内膜上还有多种其他蛋白酶参与膜间隙前体蛋白分选信号的剪切，如Oct1、m-AAA等，这些蛋白酶在线粒体蛋白质定位分选中起着重要的作用[18]。

1.3.2 GUT2基因是Imp1的酶作用物 IMP酶加工从线粒体基质输出到膜间隙的前体蛋白，该酶复合体包含两种起催化作用的组分Imp1和Imp2，它们发挥催化作用的位点在膜间隙。

这两种组分含有三种保守区域，其中包含了同源的信号肽酶和在区域I中起催化作用的丝氨酸[19-20]。

综 述・ ・收稿日期: 2014-10-15 GUT2基因编码的线粒体3-磷酸甘油脱氢酶存在于线粒体内膜上，参与细胞的碳水化合物代谢和甘油利用。

有研究显示，缺失GUT2基因的突变体在含有甘油的培养基中表现出线粒体缺失pet表现型，而在含有乙醇或者醋酸盐的培养基中的生长则与正常细胞相差无几。

在缺失GUT2基因的菌株中导入带有GUT2基因的质粒，该菌株在甘油培养基上又可正常生长。

这在一定程度上说明GUT2基因与菌株在甘油培养基上呈现出的线粒体缺失pet表现型有关[19]。

另外在正常菌株和Imp1缺失的菌株中，导入带有GUT2基因的质粒后，分别对两类菌株表达的蛋白质进行电泳，可检测到不同的条带，间接说明了Imp1影响GUT2基因的表达[19]。

1.3.3 Imp1酶作用物pGut2和pCytb2的导肽被功能性地交换 在线粒体前体蛋白转运过程中，对于膜间隙蛋白，当细胞色素b2(cytochrome b2，Cytb2)整合至线粒体内膜后首先由线粒体加工肽酶(mitochondrial processing peptidases，MPP)切掉前导序列，然后由内膜外侧的IMP水解疏水分选信号，前体蛋白成熟并被释放至膜间隙[16]。

在这个过程中， IMP 也起着信号肽酶(signal peptidase)的作用。

信号肽酶指的是在质膜蛋白插入到质膜中后去除信号肽的一组肽内切酶。

导肽又称导向序列，是新生蛋白N-末端的一段肽链，通常是20~80个带正电荷的碱性氨基酸[20-21]。

导肽对于蛋白质的定位起着重要作用。

通过交换pCytb2和pGut2的导肽，构建出两个嵌合体质粒，将质粒导入到正常和Imp1缺失的菌株中，分别标记为WT+pCytb2-mGut2、WT+ pGut2- mCytb2、△imp1+pCytb2-mGut2和△imp1+ pGut2- mCytb2菌株。

研究结果显示，导肽互换后的嵌合体菌株可以检测到较为一致的条带，另外在△imp1+ pGut2- mCytb2中被表达的短的GUT2序列不如△imp1+ pGut2- mCytb2菌株中长的Cytb2序列表达的效能高[19]。

以上结果都说明在酵母细胞中存在着Imp1酶作用物pGut2和pCytb2的导肽被功能性交换的现象，并且pGut2和pCytb2被功能性地交换后均能正常表达[19,22]。

2 GUT2基因的工业应用 甘油是一种十分重要的工业原料和添加剂，用途非常广泛，可应用于多个行业。

甘油的生产通常有三种方法:油脂皂化水解法、化学合成法和发酵法。

在发酵法中，研究较多的便是利用酿酒酵母来发酵生产甘油[23]。

根据酿酒酵母细胞中甘油的代谢途径，可通过以下三条途径来提升酵母发酵过程中甘油的产量:①缺失编码线粒体3-磷酸甘油脱氢酶的GUT2基因，甘油降解途径失效，同时也造成了甘油异化途径缺陷，使甘油大量聚集；②缺失编码线粒体外部NADH 脱氢酶的两个同功酶NDE1和NDE2基因[2]，NADH脱氢酶失活，甘油降解途径失活；③缺失编码调节甘油跨膜运输蛋白Fps1p的FPS1基因的N-末端区域，细胞不能合成Fps1p，从而使胞内合成甘油无法通过甘油通道排出，甘油在胞内聚集[24]。

利用一步基因置换法缺失GUT2、NDE1、NDE2基因，切断了胞质NADH线粒体呼吸链的氧化反应；利用两步基因置换法部分缺失FPS1基因的N-末端区域，导致甘油运输通道失控。

根据遗传学原理，对等位基因进行分离，并将不同基因型的酿酒酵母细胞融合，修饰重组以下4个基因GUT2、NDE1、NDE2和 FPSL，分别得到不同基因重组的菌株。

实验结果表明，各个菌株均在一定程度上提高了甘油的产量，其中同时缺失以上4个基因的菌株在切断甘油降解途径的同时促进了甘油的生产，因此甘油产量大幅度提高，从而获得了期望的高产甘油酵母菌株。