药用真菌金耳的rDNAITS序列分析与鉴别

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rDNA-ITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展

rDNA-ITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展仇萌;邹先彪【摘要】目前深部真菌病的发生率呈逐渐上升趋势,有关深部真菌菌种的鉴定成为研究热点.由于传统的菌种鉴定方法存在费时及易受实验条件影响等不足,核糖体rDNA-ITS序列分析法已越来越广泛的应用于真菌属内不同种间的系统发育研究中.本文综述了核糖体rDNA-ITS鉴定深部真菌菌种的研究进展,展望了其应用前景.【期刊名称】《中国真菌学杂志》【年(卷),期】2011(006)002【总页数】4页(P122-125)【关键词】ITS区;鉴定;深部真菌【作者】仇萌;邹先彪【作者单位】解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京,100048;解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京,100048【正文语种】中文【中图分类】R446.53近年来,随着医学技术的飞跃发展,抗生素、免疫抑制剂、皮质类固醇激素在临床得以广泛应用,介入治疗、器官移植、导管插管等技术普遍开展,又因免疫障碍和艾滋病的流行,深部真菌感染呈持续上升趋势,且预后较差,病死率高。

引起深部真菌感染的真菌种类很多,临床常见的有念珠菌、隐球菌、曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、孢子丝菌等。

有报道,念珠菌属的感染在获得性血液感染中已经占第 4位,是院内真菌感染的 78.3%。

近年来,曲霉菌感染已经上升到了深部真菌感染的第 2位[1]。

深部真菌感染的诊断一直是临床微生物实验室的主要难题,其早期诊断对深部真菌感染的临床结果有着重大影响,在越来越多的耐药菌株出现后,菌种鉴别的重要性已不容忽视。

传统的真菌分类方法主要根据真菌的形态学、生理生化特点及生理生化指标来来进行分析,但由于某些真菌属、种之间的形态学或生理生化差异极不显著,且真菌的培养和检出需要特殊培养条件和方法以及多数真菌的生长缓慢等特点的影响,给真菌鉴定工作带来困难。

随着 1953年 DNA双螺旋结构的提出,分子生物学检测手段被发现在真菌快速检测和鉴定方面有巨大的潜能,包括多聚酶链式反应(polymerasechain reactions,PCR)、限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism,RFLP)、分子杂交及随机扩增多态性分析DNA(random amplification of polymorphic DNA,RADP)等[2]。

rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估

关键词：内转录间隔区；因测序；基丝状真菌；形态学鉴定
ＥｖｌａｉｎｏＤＮＡ－ｎｅｎｌｔａｓｒｂｄｓａｅｅｉｎｓｔｒｅｓｆｒｍｏｅｕａｄｎｉｃｔｎｏｌｉａａｕｔｏｎｒｉｔｒａｒｎｃｉｅｐｃｒｒｇｏｓａａｇｔｏｌｃｌｒｉｅｔａｉｆｃｉｃｌｉｆｏｎ
ＴｅｆｎｔｎｏＬＴｉｅＢａｋａｔ — ｅｅａｉｇｓｓｍｒｐｙｏｅｅｉｔｅｎｏａａｉｅｉｄｃｔｒｗｓｈｌｆｌｏｈｃｉｆＡＳＧｎｎｕｏｇｎｒｔｙｔｆｈｌｇｎｔｒｅａｄｃｍｐｒｔｉａｏｓａｅｐｕｕｏＢｎｎｅｏｃｖｎｔｄｔｒｎｈｉｈｈｍｏｏｏｓｓｑｅｃｓＴｅｒｓｌｈｕｄｂｏａｅｉｈｒｈｌｇｃｌｉｅｔｃｔｎａｄｔｅｅｅｍｉｅｔｅｈｇｏｌｇｕｅｕｎｅ．ｈｅｕｔｓｏｌｅｃｍｐｒｄｗｔｔｅｍｏｐｏｏｉａｄｎｉａｉｎｈｓｈｉｆｏ
ｃａａｔｎＰＲ）ａｐｉｃｔｎｎｈＣｒｄｃｓｗｒｓｑｅｃｄａｄｃｍａｅｉｈａａｉｅＢｎ．ｈｉｒｃｉ（Ｃｎｅｏｍｌａｏ，ａｄｔｅＰＲｐｏｕｔｅｅｅｕｎｅｎｏｐｒｄｗｔｔｄｔｎＧｎａｋｉｆｉｈｅ
摘要：目的评价内转录间隔区（Ｔ）ＩＳ的多态性序列分析（ＤＡＩＳ序列分析）临床少见丝状真菌的鉴定ｒＮ — Ｔ对作用，以形态学鉴定方法加以补充验证。方法将３株待检真菌通过聚合酶链反应（Ｃ扩增和基因测序方法ＰＲ）

金针菇rDNA—ITS序列分析

ＫｅｒｓＦａｍｕｎｅｔｅ；ｔｒａｔｎｃｂｄｓａｅ（）ｓｑｅｃ；ｈｌｅｙｙｗｏｄ：ｌｍｌａｖｌｉｓｉｅｎｌｒｓｒｅｐｃｒＩｉｕｐｎａｉｅｕｎｅｐｙｏｎｇ
金针菇（ｌｍｍｌａｖｌｔｅ）名又称毛柄Ｆａｕｉｅｉｓ别ｎｕｐ
ｍａｌＤＮＡｒｍｌｍｍｕｉａｖｌｔｐｓ，ｔｅｇｎｍｉｆｏＦａｌｎｅｕｉｅｈｅｏｃＤＮＡｎｔｒｉｉｄｅｆＦａｉｈｅｆｕｔｂｏｉｓｏｌｍｍｕｉａｖ — ｎｇｌｎｅｌｔｐｓｆｏｄｆｅｅｔｏｇｎｒｘｒｃｅｕｉｅｒｍｉｆｒｎｒｉｓｗｅｅｅｔａｔｄ．ＴｈｎｅｎｌｔａｓｒｂｄｓｃｒｏｉｅｉｔｒａｒｎｃｉｅｐａｅｆＤＮＡｓａｌ— ｗａｍｐｉｌｄｕｉｇＰＣＲｎＴＳｓｑｎｃｓｗｅｅｏｔｉｅｆｅｓｎａｄＩｅｕｅｅｒｂａｎｄ．ＮＣＢ１ｗａｕｍｉｔｄｔｈｎＢａｔｂｓｓｓｂｔｅｏｔｅＧｅｎｋＤａａａ・ｅｆａｄｒｇｓｅｅｕｓｏｎｅｉｔｒｄｎｍｂｅｓｏｔｉｅ．ＴｈＴＳｓｑｅｃｓｏａｒｗａｂａｎｄｅＩｅｕｎｅｆＦｌｍｍｕｉａｖｌｔｓｉｈｓｒ — ｌｎｅｕｉｎｔｉｅｐｅ
金针菇ｒＮＤＡ— Ｔ序列分析ＩＳ
金华邹吉祥２朴仁哲郭鹏吴凡姜国斌，，，，，
（．１大连民族学院环境与资源学院，宁大连１６０；辽１６５２延边大学农学院，．吉林延吉１３０）３００

3种药用红树植物rDNA ITS序列初步研究

3种药用红树植物rDNA ITS序列初步研究
牛宪立;吴群;姬可平
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2011(038)017
【摘要】应用改良CTAB法分别提取生长于珠海和海南的3种药用红树植物秋茄、老鼠簕和桐花树的基因组DNA,以真核生物rDNA ITS区的通用引物分别对其rDNA ITS区进行nPCR扩增及测序,并对测序结果进行对位排列.结果表明,不同来
源的药用红树植物的rDNA lTS序列上存在扩增碱基差异,rDNA ITS测序结果可作为鉴定药用红树植物种质资源的分子标记之一.
【总页数】3页(P109-110,116)
【作者】牛宪立;吴群;姬可平
【作者单位】遵义医学院珠海校区生化与细胞分子生物学教研室,广东珠海519041;武汉市第二中西医结合医院检验科,湖北武汉201319;遵义医学院珠海校
区生化与细胞分子生物学教研室,广东珠海519041
【正文语种】中文
【中图分类】Q789
【相关文献】
1.白木香rDNA ITS序列测序鉴定的初步研究 [J], 牛宪立;姬可平;吕国庆
2.濒危药用植物盘龙参 rDNA ITS 序列分析 [J], 李家敏;周秀玲;姜琼
3.广西药用红树植物种类及其民间药用功效研究 [J], 宁小清;林莹波;谈远锋;黄艳;
李军芳;邓家刚
4.背角无齿蚌和三角帆蚌的rDNA基因ITS1及ITS2序列的初步研究 [J], 戈志强;陆丽萍;左开俊
5.苏皖产大戟属药用植物rDNA的ITS序列分析 [J], 蒋继宏;孟娜;曹小迎;周守标;戴传超
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rDNA-ITS序列分析鉴定块菌伴生真菌

ＺｈｏｕＪｉａｎｐｉｎｇ，ＷｅｉＨｕｉｐｉｎｇ（ＭｅｄｉｃｌａＳｃｈｏｏｌ，ＰａｎｚｈｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００，Ｃｈｉｎａ）
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－０９７２．２０１３．０３．０１７
ｒＤＮＡ — ＩＴＳ序列分析鉴定块茵伴生真菌
周建平，韦会平
（攀枝花学院医学院，四川攀枝花６１７０００）
０引言
块菌（ｔｒｕｆｌｆｅ），别名松露，具有独特的香味、口
后利用ｒＤＮＡ．ＩＴＳ序列分析方法对分离菌株进行了
ＩＴＳ序列分析，获得了各菌株与块菌问的系统进化
关系图谱，对７株块菌伴生真菌进行了初步的分子生物学种属鉴定．
感和营养价值，是一种珍贵的野生食用菌．块菌市场价格昂贵，天然分布范围狭窄，中国攀枝花和欧洲地中海沿岸地区是块菌的天然分布中心，其年产量难以满足市场需求 ¨ Ｊ．进行食用菌的人工种植
１材料与方法
１．１菌株来源
是解决市场供需矛盾的重要方式，但块菌的人工种植至今没有成功，其原因可能与块菌生长所需的独特生境有关Ｊ．其根系伴生真菌的种类及数量可
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｌｄｔｒｕｆｌｆｅ・－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｕｎｇｉｉｎＰａｎｚｈｉｈｕａａｒｅａｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｒＤＮＡ－－ＩＴＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｍ・－

rDNA_ITS序列分析在真菌鉴定中的应用_燕勇

[基金项目] 浙江省档案局科研项目(2007-9)[作者简介] 燕勇(1974-),男,学士,主管技师,主要从事微生物检验工作。

=论著>r DNA -I TS 序列分析在真菌鉴定中的应用燕勇,李卫平,高雯洁,沈志英,王恒辉,陈黎霞(浙江省嘉兴市疾病预防控制中心,浙江嘉兴 314050)[摘要] 目的:通过对3株真菌的rDNA -I T S 序列进行分析,以探讨、说明基于核糖体RNA 基因(即rDNA )内转录间隔区(In ternal T ranscribed Spacer ,I T S)的多态性的序列分析(rDNA -I T S 序列分析)在真菌鉴定中的应用。

方法:通过PCR扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的rDNA -ITS 序列,从GENBANK 获取相似序列,使用BLA S T 和DNAMAN 工具对r DNA -I TS 序列进行比对分析。

结果:1号真菌菌株与X y l a riales sp 1LM 40(属炭角菌目)同源性高,但尚不能鉴定到具体的属、种;2号真菌菌株可鉴定到种,为草酸青霉Penic illi u m oxa li cu m;3号真菌菌株可鉴定到种内组水平,为近平滑假丝酵母III 组(最新命名为Candida m etaps il o si s)。

结论:相对于传统的真菌形态学鉴定方法,rDNA -ITS 序列分析用于真菌鉴定更客观、省时、简便、快速,但目前也存在一定的应用限制(受基因库的完善程度、高度同源性序列的多少以及具体物种ITS 区的可变程度等影响)并不能鉴定出所有真菌,宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定。

[关键词] r DNA;内转录间隔区(ITS);PCR;测序;真菌;鉴定[中图分类号] R 44615 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2008)10-1958-04Application of r DNA I TS sequence analysis in fungus identificationYan Yong,L iW ei -p ing ,Gao W ei -jie ,Shen Zhi -y in g,W ang H eng-hui ,Chen L i -x iao (Jiax ing Cente r for D i sease Contro l and P reventi on ,Ji ax i ng 314050,Chi na)[Abstract] O bjective :T o introduce and illu m i nate t he applicati on o f r DNA I T S sequence ana l ysis i n f ungus i dentifica ti on on basis o f sequence and l eng t h poly m orph i s m s o f i nterna l transcr i bed spacer(I TS)i n ri bosoma l RNA gene(rDNA )1M ethods :T he three pend i ng fungus stra i ns c rDNA I T S sequences tested by PCR a m plifi cati on and sequenc i ng m e t hods were analyzed and co m-pared w ith si m ilar sequences fro m G E N BANK by N CB I BLAST on li ne too l and DNAMAN so ft w are 1Resu lts :N o 11f ungus stra i n had a h i gh hom ology w it h X y l a riales sp 1L M 40,bu t w as no t yet i den tifiab le on genus or spec ies l eve l o f taxonom ic c l assifi ca -ti on 1N o 12strai n w as i den tified as P en icilliu m oxalicu m,a genus l eve l 1N o 13strai n w as i dentified as Cand i da m etapsil os i s ,ne w desi gnati on of Candida parapsilosis group III ,a g roup l eve l i n spec ies re l a ti ve l y 1Conc l u si on :Compared w ith the traditiona lm or -pho l og ical i den tificati on m ethods ,the r DNA ITS sequence ana lysis i s m ore ob j ective ,ti m e-sav ing ,convenient ,and fast for fun -gus identificati on ,butw it h so m e appli ed li m its currently 1D epended on the perfecti on deg ree o f gene database ,the nu m ber o f h i gh-deg ree homo l ogy sequence ,t he var i ability ex tent of ITS reg i on of biolog ical i nd i v i duals and so on it can be app lied 1T hen ,it does not identif y all f ung ,i and shoul d be co m bi ned w ith the trad iti ona lm orpho l og i ca l identificati on m et hods for f ungus identificati on 1[K ey words] r DNA;Inte rnal transcr i bed spacer(ITS);PCR;Sequenc i ng ;F ungus ;Identifi cation 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S r DNA 、5S r DNA 、18S rDNA 和518S r DNA 4种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。

rDNA ITS 序列分析在植物种属鉴定中的应用与研究

rDNA ITS序列分析在植物种属鉴定中的应用和研究黄凤玲遵义医学院珠海校区（广东珠海，519041）摘要：rDNA ITS序列分析方法用于植物系统种属鉴定与进化研究有较高的可靠性。

由于高等植物rRNA基因上的18SrDNA、ITS及5SrDNA片段常具有变异位点[1]，通过DNA序列测定核基因组的rDNA ITS 序列，根据测序结果进行比较就可以鉴定植物的种属关系，对于植物的鉴定有非常重要的意义和作用。

关键词：rDNA ITS序列；植物；种属鉴定分子生物学研究发现，生物种类所依赖的资源—“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性又直接体现在DNA分子水平上的检测。

21世纪以来，现代分子生物学技术在植物的研究取得突破性进展，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术便得到验证，为不同植物的分类、鉴定等提供了更丰富、更可靠的手段。

其中，核糖体基因（rDNA）的内转录间隔区（ITS）在植物的种、属鉴定的研究得到广泛的应用。

1 rRNA基因（rDNA ）的基本结构及ITS区高等植物中有4种rRNA,即 5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA，前三者的基因组成一个转录元，是高度重复的串联序列单位。

近年来，随着分子生物学技术在生物系统研究等领域的广泛应用，以PCR为基础的各种分子生物学技术在植物鉴定方面的应用报道日益增多。

rRNA基因（rDNA ）是目前分子系统研究中普遍采用的分子标记基因之一，它是一种中等重复并有转录活性的家族。

核糖体RNA及其相邻的间隔区合称为rDNA [2]。

rDNA中存在着广泛的保守区域，可以用作引物的结合位点，它们的不同区域可反映物种不同的进化水平。

真核细胞rDNA有几十甚至数千个拷贝，其中2个内部转录间隔区ITS-1、ITS-2将18S、5.8S、28S分隔开；不同的选择压力作用于rDNA区域，造成单个重复单位序列不同的保守性。

每一部分都可以用作特殊的生物系统分析。

利用ITS序列鉴定真菌

利用ITS序列鉴定真菌一、实验目的1，了解利用ITS序列鉴定真菌的原理；2，掌握用ITS序列鉴定真菌的方法步骤二、实验原理菌物是真核生物的重要类别，传统的菌物分类以子实体形态特征和生理生化指标为分类基础，由于部分菌物的子实体不易获得，形态特征不易掌握，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，使传统的菌物鉴定工作困难或分类系统意见分歧。

内转录间隔区ITS，位于18S和5.8S rDNA（ITS1）之间以及5．8S和28S rDNA之间（ITS2），ITS1和ITS2常被合称为ITS，并且5.8S RNA基因也被包括在ITS之内。

近年来，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR 扩增、测序。

随着核糖体rDNA ITS序列分析技术在菌物研究中的应用，一些分类地位不明确、亲缘关系不清楚的物种通过该技术得到了解决，一些重要的菌物遗传信息得到阐明。

三、实验材料仪器用具：恒温水浴锅，移液器，离心机，核酸蛋白分析仪，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像系统，PCR仪，离心管，微量移液器，枪头，一次性手套， PCR管 (0.2ml)；材料：金针菇试剂：1，基因组DNA提取试剂：氯仿-异戊醇(25︰1)；无水乙醇；蒸馏水；70%乙醇；TRIS饱和酚(pH 8.0) 提取液（Tris–HCl 1mol/L pH 8.0）2，特异性片段的PCR扩增试剂:MgCl2（25mM）；琼脂糖；DNA分子量标准物（100bp ladder）；10x缓冲液（Mg2＋free）；dNTP（10mM each）；Tag酶（5U/μL）；DNA模板；10μM引物：upper (31bp)；lower (30bp)3，ITS引物四、实验方法与步骤1，金针菇因组DNA的提取（TRIS 饱和酚一步法）。

⑴称取新鲜金针菇约0. 5 g ,置于洁净的小研钵中；⑵向研钵中直接加入1 ml TRIS饱和酚(pH值为8.0) 提取液,充分研磨至糊状；⑶用尖端剪除0. 5 cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到2 ml的离心管中,充分振荡约1 min ,随即加入0. 5 ml的氯仿-异戊醇(25︰1) ,轻轻振荡混匀；⑷将离心管于4 ℃,12 000 r/ min 离心10 min ,吸取上清于新离心管中,每管加入2 倍体积的无水乙醇,冰上放置10 min ；⑸4℃，12000 r/ min离心10 min ,弃上清；⑹沉淀用70 %乙醇漂洗2 次,超净工作台中吹干后,加50μl的蒸馏水溶解, - 20 ℃保存备用。

基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究

摘要本实验是利用采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌子实体作为研究对象，通过常规CTAB法对该子实体进行基因组DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4对特异的DNA片段进行PCR扩增，将扩增产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，并在紫外透射反射分析仪下观察检测的结果，对于较好的扩增产物利用回收试剂盒进行纯化，后将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将测序所得到的序列输入GeneBank数据库中的局部相似性查询（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)程序进行比对，列出数据库中与所测得到的序列同源性较高的序列信息并进行分类鉴定，然后运用软件raxmlGUI进行系统发育树构建。

最终的研究结果显示该菌种属于报道的choiromyces helanshanensis。

关键词：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物学；鉴定AbstractIn this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongolia, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were tested by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of the gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong for DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequencedsequences and perform the classification and identification. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final results showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia.Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification目录引言 (1)1 材料与方法 (3)1.1 实验材料 (3)1.2 实验设备及药品 (3)1.2.1 试剂配方 (3)1.3 实验方法 (3)1.3.1 基因组DNA的提取 (3)1.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增 (4)1.3.3 PCR扩增产物的回收和纯化 (5)1.3.4 DNA测序分析 (5)2 结果与分析 (6)2.1 PCR产物的检测 (6)2.2 提纯效果的检测 (6)2.3 rDNA ITS序列的同源性分析 (7)2.4 raxmlGUI系统发育树分析 (9)3 结论与讨论 (10)参考文献 (11)致谢 (12)引言贺兰山坐落于宁夏回族自治区的西北部，是银川平原的原始屏障，也是三北防护林建设的重点地段[1]。

rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分类鉴定中的应用

ＡｂｔａｔＴｉｐｐｒｓｍｍａｉｅｔｅｒｓｒｃ：ｈｓａｅｕｒｓｈＤＮＡ－ＴｓｑｅｃａａｙｉｔｃｎｌｇｐｉｃｐｅｔｃｎｃｌｚＩＳｅｕｎｅｎｌｓｓｅｈｏｏｙｒｎｉｌ，ｅｈｉａ
析及病原腐霉的诊断和比较各种类的亲源关系上，例如对群结腐霉菌的鉴定．
３４其他分子生物学技术的应用聚合酶链式反应一链构象多态性分析（ＰＲｓｃ）．单Ｃ — ｓＰ是一种有较高开发潜力的技术，
目前在植物病原菌分类鉴定中用的还比较少．Ｃ — ＳＰＤＡ指纹技术以及ＤＡ直接测序法一样有简单快速的特点，ＰＲＳＣ和ＮＮ
ｕｉｕＴｏｈｍｍｒｗ的检测．
３３ＲＦＰ、．ＬＲＡＰ和ＡＦＰ在腐霉分子研究上的应用限际性长度多态性分析（ＲＬ）酶切的方法对ＤＡ进行序ＤＬＦＰ利用Ｎ
列多态性分析．在真菌的分类鉴定中，ＲＬ技术主要用于分析相似种间的亲源关系及种内变异性．ＦＰ例如采用ＰＲＲＬＣ — ＦＰ图
而且更加经济实用、敏度会更高，是对于处理大批量的样品时，Ｃ — ＳＰ比常规ＰＲ更有优势，只需要一对通用灵尤其ＰＲＳＣＣ引物就能够同时对多个腐霉种进行鉴定．对不同的腐霉菌株采用ｒＮ —Ｔ１Ｃ — ＳＰ析，同的腐霉种都有特例如ＤＡＩＳ的ＰＲＳＣ分不征ＳＣ条带，利用这一技术可将腐霉鉴定到种．ＳＰ线粒体ＤＡ（ＤＡ）ＮｍｔＮ用于腐霉进化和系统研究有一定的优势．例如采用不同种属的腐霉菌的细胞色素 Ⅱ（ＣＸ基因Ｏ Ⅱ）序列来研究腐霉属的系统发育关系；利用线粒体细胞色素氧化酶 Ⅱ基因及间隔区基因序列分析，把从形态特征上很难区别的菌株区分开．目前ｍＤＡ分析方法在腐霉的分子研究上应用还较少，将来通过技术革新，ｔＮ有希望在腐霉ＤＡ分析鉴定Ｎ

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天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2007,19:2162220文章编号:100126880(2007)022*******　收稿日期:2006206219 接受日期:20062082283通讯作者Tel:86221262232019;E 2mail:wiqn@bi o .ecnu .edu .cn药用真菌金耳的r DNA I TS 序列分析与鉴别刘春卉,瞿伟菁3,张　雯,焦　磊华东师范大学生命科学学院,上海200062摘　要:研究了两个居群的金耳Tre m ella aurantialba 以及近似品的r DNA I TS 区碱基全序列的特征及其差异,首次报道了金耳的I TS 和5.8Sr DNA 完整序列,序列总长度为467～468,长度变异较少。

聚类分析表明两个居群金耳亲缘关系非常密切,金耳药材和近似品金黄银耳形成一个稳定的独立分支,近似品黄金银耳形成另一个分支。

I TS 序列的差异为金耳的鉴别提供了可靠的分子标记,为金耳菌类药材基原入药建立了遗传基础。

关键词:金耳;核糖体DNA;I TS 序列;居群;近似品;DNA 分子鉴别中图分类号:R28415文献标识码:AD NA M olecul ar I den ti f i ca ti on of M ed i c i n a l M ushroo mTrem ella au ran tia lba Ba sed on I TS SequencesL I U Chun 2hui,QU W ei 2jing 3,Z HANG W en,J I A O LeiSchool of L ife Science,East China N or m al U niversity,Shanghai 200062,ChinaAbstract:The r DNA I TS sequences fr om t w o populati ons in China were studied and three anal og s pecies were discussed t ogether .The whole sequences of r DNA I TS regi ons (including I TS 21,5.8S and I TS 22)of T re m ella aurantialba were re 2ported first ti m e .The results showed that little difference in length bet w een the sequences was f ound and the length was 467bp and 468bp,res pectively .T re m ella aurantialba and T re m ella aurantia f or med a separate stable branch in the t opol 2ogy trees,while T re m ella m esenterica clustered on another clade .The relati onshi p bet w een t w o populati ons of Tre m ella aurantialba in Yunnan and Shanxi p r ovinces and Tre m ella aurantia is cl osely related,and they can rep lace each other asthe sa me medicine according t o the r DNA I TS .The character of I TS sequences can be used f or p r oviding the molecular markers f or identifying Tre m ella aurantialba and exp l oring its genetic basis of fungal s ources .Key words:Tre m ella aurantialba ;r DNA;I TS sequence;populati on;anal og s pecies;DNA molecular identificati on 金耳来源于担子菌纲银耳科银耳属植物金耳(Tre m ella aurantia lba )的金黄色脑状子实体,为珍稀濒危真菌,民间对其药用历史悠久,《本草纲目》和陶弘景《名医别录》有记载,《中国药用真菌》述其主治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等症[124]。

同属还有近似种金黄银耳T re m ella aurantia Sch w:Fr 、脑状银耳Tre m ella encephala Pers .、黄金银耳(与橙黄银耳同物异名)Tre m ella m esenterica Retz .:Fr .。

现代药理研究发现金耳富含水溶性多糖,连续服用金耳子实体能化痰止咳并对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有显著的降糖作用[5],金黄银耳子实体多糖也能明显降低正常小鼠及链脲霉素致高血糖小鼠血糖和血浆胆固醇水平[6,7],黄金银耳子实体有较强的平喘作用[8],其多糖也有降低大鼠高血糖作用的报道[9]。

由于金耳颜色和外形与几个近似种极为相似且易混淆,金耳种名一直被误定为Tre m ella m esenterica [10,11],原产中国的金耳药材主流资源直至二十世纪九十年代才得以确认并正式定名T re m ella aurantial 2ba Bandoni et Zang [12,13]。

鉴于同属的近似品种较多,依据单纯形态学方法和化学成分难以鉴别,同时近似种已有相似药理作用的报道,为防止品种源头混乱,保护种质资源,解析其它近似种的种质差异及可替代性,因此对金耳药材基源及其遗传基础进行准确界定,不仅有助于规范资源的生产和保存,也可丰富生药资源库和数据库的基础信息。

通过检索Gen Bank 和E MBL 数据库,发现近似种金黄银耳Tre m ella aurantia 、脑状银耳Tre m ella encephala 、黄金银耳Tre m ella m esen terica 的r DNA I TS (核糖体内转录间隔区)序列均已注册,而金耳Tre m ella aurantial 2ba的I TS序列尚无录载。

真菌核糖体中的内转录间隔区序列的进化速率较快,可以提供较丰富的变异位点和信息位点,不仅广泛用于近缘属间、属内种间的分子系统学及鉴别,而且也被用于种内居群间的差异性研究,为此研究选择国内两个地域较远的金耳品种的r DNA I TS区碱基全序列作为分子标记进行测定,并结合Gen Bank收载的近似品的I TS序列进行分析,试图为金耳药材的种质鉴定提供分子依据。

1　材料和方法1.1　材料金耳Tre m ella au rantialba子实体分别为9901产地为云南丽江(简称A13),9102产地为山西(简称A23,以下括号内均为简称),由瞿伟菁教授鉴定。

GenBank收载本研究引用的其它银耳属真菌及其GenBank登录号如下:金黄银耳Tre m ella aurantia AF444315(Ta)、脑状银耳Tre m ella encephala AF410474(Te1),AF042404(Te2),AF042402(Te3)、黄金银耳Tre m ella m esenterica AF042448(T m1), AF042443(T m2)、银耳(白木耳)Tre m ella fucifor m is AF444316(Tf)。

1.2　总DNA提取总DNA提取基本依照氯化苄法[14]略加改进,步骤如下:收集消毒供试子实体各0.1g,加0.5mL 提取液(0.1mol/L Tris HCl,pH9.0和0.04mol/L EDT A,pH8.0)研磨混匀,加0.1mL10%S DS和013mL氯化苄充分混匀,50℃保温1h,加0.3mL3 mol/L Na OAc(pH5.2)混匀,冰水浴15m in,6000 r pm室温离心15m in,取上清加等体积无水乙醇室温沉淀20m in,去上清,10000r pm室温离心15m in,沉淀用70%乙醇洗一次,风干后水溶,4℃保存, 1.5%Agr ose琼脂糖凝胶电泳(100V电压下电泳30m in)检测纯度和分子量范围。

1.3　r DNA I TS区的扩增、纯化和测序采用双向PCR反应扩增I TS125.8S r DNA2I TS2整个片段,用18S r DNA3′端引物作上游引物I TS1: 5′2CGT AACAAGGTTT CCGT AGG23′,用28S r DNA5′端引物作下游引物I TS4:5′2TCCTCCGCTT ATT2 G AT ATGC23′。

反应体系(50μL)含:模板:5×1029 g,引物I TS1和I TS4(2×1025mol/L)各1μL,10×PCR缓冲液(pH8.3)5μL,dNTP(0.01mol/L)4μL,Taq酶(5U/μL)0.25μL(引物和Marker购自上海生工,Taq酶和dNTP购自大连宝生物公司),灭菌双蒸水定容至50μL,加好后上盖石蜡油25μL。

扩增条件:94℃预变性5m in,94℃1m in,55℃45s,72℃1m in,循环30次,72℃延伸5m in,产物于4℃保存。

Agr ose琼脂糖凝胶电泳检查产物(Marker分子量范围100～1200bp),产物纯化回收(北京鼎国公司PCR产物试剂盒),每样平行重复5次,纯化后的产物以与PCR相同的引物双向直接测序(华大基因上海鼎安公司完成)。

1.4　序列分析用DNAStar(DNAStar,I nc.1996)软件包编辑, ClustalW对位排序,在线BLAST检索,从Genbank 中提取其它相关真菌的I TS序列,用Mega2.0分子进化遗传分析软件,选择药性较近的药用菌木耳A uricularia auricular AF291268(Aa)作为外类群[1,15],统计和分析序列的变异情况,采用系统学分析软件P AUP4.0中的邻接法(neighbor2j oining method,NJ),最大简约法(maxi m um parsi m ony meth2 od,MP)和最大似然法(maxi m um likelihood method, ML)推测系统关系。