组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤切片免疫荧光染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究组织或细胞样本中的特定蛋白质标记。
下面是一般的切片免疫荧光染色的具体步骤：步骤一：取样步骤二：切片将固定的组织样本或细胞样本进行切片处理。
可以使用切片刀或者切片机来获得薄片。
切片的厚度往往是几微米到几百微米。
切片完成后，可以将其放在载玻片上。
步骤三：预处理载玻片上的切片需要进行一些预处理步骤，以去除可能会影响后续染色的物质，如脂质或其他杂质。
预处理步骤可能会包括洗涤、脱水和透明化等。
步骤四：抗原修复细胞或组织样本中的抗原有时会受到固定过程的影响，使得抗原无法与抗体结合。
因此，需要进行抗原修复步骤来恢复抗原的免疫原性。
抗原修复可以通过热处理、酸碱处理或酶解等方式进行。
步骤五：阻断非特异结合物为了减少非特异抗体的结合，需要使用一种阻断剂来防止非特异结合。
典型的阻断剂包括牛血清蛋白、胎牛血清等。
阻断剂可以在洗涤缓冲液中加入。
步骤六：初级抗体染色在预处理和阻断步骤之后，将含有特定初级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
初级抗体是特异性结合到目标蛋白质的抗体。
孵育时间和温度可以根据实验的需要来确定。
步骤七：洗涤之后，用缓冲液洗涤样本，将未结合的抗体和杂质去除。
洗涤是非常重要的步骤，可以通过多次洗涤来提高特异性和背景的对比度。
步骤八：二级抗体染色二级抗体通常是带有荧光标记的抗体。
与初级抗体相比，二级抗体对特定的初级抗体更具选择性，并且能够增强荧光染色的信号。
将含有二级抗体的溶液加到样本上，进行孵育。
步骤九：洗涤与前面的步骤类似，需要用缓冲液洗涤样本，去除未结合的二级抗体和杂质。
步骤十：荧光显微镜观察片片染色完成后，放入荧光显微镜中观察。
通过荧光显微镜，可以看到标记的荧光信号并进行图像记录和分析。
需要注意的是，切片免疫荧光染色步骤根据具体实验目的的不同可能会有所不同。
此外，具体的步骤和实验条件可以根据实验室的需要进行优化和修改。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。
（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。
（11）次日取出切片，室温下复温 30min。
（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。
（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。
（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。
贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
组织-免疫荧光染色
组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo—1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%—100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X-100透化2—5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5％BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里,4度过夜9、1×PBS洗3次,每次10分钟10、加二抗(用1％BSA稀释)30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛,0.2%Triton，5％BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1。
取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3。
0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。
4。
与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5。
一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好,PBS洗三遍。
6。
二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7。
最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；•2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37•0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
1 直接免疫荧光法的操作步骤
标本的处理：
石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0。
01M PBST漂洗5min × 3/次；
• 2％BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min
•抗体染色：
C孵育30min;︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体（1：8或1:16稀释），放在湿盒中，37
• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡（洗去多余游离的荧光素标记的抗体）。
•缓冲甘油封片
–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9。
2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制.
•镜检:在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ
•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；
•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；
–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；
C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果,但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒)可采用0—2︒C),高于37︒–染色温度：多采用室温（25
C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37
•试验时需设置下列对照：
–自发荧光对照（空白对照）：标本加0。
01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验）:标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体.
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色.
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
•经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
2 间接法又称为荧光抗—抗体法
需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记）。
一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
ϕ
–可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
间接免疫荧光法操作步骤κ
•标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
•一抗染色：
C过夜。
︒C作用30min或4︒–加未标记的特异性抗体（通常1:100稀释，用0。
01MpH7.4的PBS稀释），37
• 0。
01M PBST漂洗5min×3次（震荡漂洗）；
C湿盒避光作用30min。
︒•加荧光标记的二抗抗体，37
• 0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗）；
•甘油缓冲液封片
•镜检
•优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
•缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多.
间接免疫荧光法的注意事项
•荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h，时间过长,会使荧光减弱。
•每次试验时，需设置以下三种对照：
–阳性对照：阳性血清+荧光标记物
–阴性对照：阴性血清+荧光标记物
–荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
•标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
•一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。