免疫荧光染色步骤
标准的免疫荧光染色步骤
这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。
2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。
3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。
4）PBS洗三遍，每次5分钟。
5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。
6）PBS洗三遍，每次5分钟。
7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。
8）加入1抗，室温孵育1 小时。
9）PBS洗三遍，每次5分钟。
10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。
11）PBS洗四遍，每次5分钟。
12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。
13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。
14）加入20 ul封片剂封片。
15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。
注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。
如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。
组织-免疫荧光染色
组织免疫荧光步骤：
1）取出切片，用 M PBS冲洗5min×3次；
2）滴加10%正常山羊血清37℃封闭45 min；
3）吸去多余液体，加入抗TSHR的一抗（1：100），放入湿盒中，37℃孵育1h后置于4℃冰箱中过夜（保持在湿盒中）；
4） M PBS冲洗5min×3次；
（至下一步开始要适度避光操作，防荧光淬灭！）
5）在黑暗条件下加入山羊抗兔IgG-FITC（1：200），37℃温育45 min；6）在黑暗条件下吸弃二抗 (注：不再冲洗)，加入DAPI染液（μg/ml），室温作用20 min；
7）在黑暗条件下 PBS冲洗5min×6次；
8）在黑暗条件下防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。
核实好下边的问题你就可以操作了：
1、准备 M PBS 500 ml，冲洗时动作既要轻柔防脱片，又要保证冲洗
彻底；
2、抗TSHR的一抗用1：100，用抗体稀释液稀释；
3、实验室有没有山羊抗兔IgG-FITC，使用浓度是1：200；
4、DAPI染液（μg/ml）实验室有吗
5、防荧光淬灭剂封片实验室有吗。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光三色染色步骤
免疫荧光三色染色步骤免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。
下面是免疫荧光三色染色的步骤：1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。
可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。
2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。
常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。
3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。
4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。
5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。
二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。
6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。
7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。
8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。
通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。
这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。
需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。
此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。
随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。
2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。
3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。
4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。
5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。
6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。
7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。
8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。
请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2︒C)，高于37︒–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光染色原理
免疫荧光染色原理免疫荧光染色是一种常用的实验技术，通过特异性抗体与荧光染料的结合，可以实现对目标分子的标记与检测。
这种技术广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
本文将介绍免疫荧光染色的原理及其相关操作步骤。
免疫荧光染色的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
抗体是由机体产生的蛋白质分子，具有高度特异性，可以与抗原（即分子标记）结合。
在免疫荧光染色中，需要选择与目标分子特异性结合的抗体，并将其标记上荧光染料。
在实验中，将荧光染色的抗体与待检测样品接触，待抗体与目标分子结合后，通过荧光显微镜观察，就能够检测到目标分子的存在与位置。
免疫染色的步骤包括样品制备、抗体处理、荧光探针标记、冲洗和观察等几个关键步骤。
首先，样品制备对于免疫荧光染色非常重要。
样品类型可以是细胞、组织或液体等。
对细胞样品，需要将其固定在载玻片上；对组织样品，需要将其切片。
固定和切片是为了保持样品的完整性，并使目标分子易于与抗体反应。
第二步，抗体处理。
这一步骤是为了使抗体与目标抗原结合。
首先，需要选择特异性结合目标分子的抗体；然后，将抗体稀释至适当浓度，并加入到固定的样品中；随后，将样品与抗体混合，使其充分接触。
第三步，荧光探针标记。
在实现目标分子与抗体结合后，需要使用荧光探针标记抗体。
这一步骤是为了增加目标分子在荧光显微镜下的可视性。
荧光探针通常以染料的形式存在，并能够与抗体特异性结合。
将荧光探针与抗体混合后，将其加入到样品中，并在一定的温度下孵育一段时间，使其充分地反应。
第四步，冲洗。
当抗体与荧光探针与目标分子结合后，需要用洗涤液洗去未结合的抗体和荧光探针，以减少非特异性背景信号的干扰。
最后，观察。
将处理后的样品置于荧光显微镜下，通过设置特定波长的荧光显微镜滤镜，在适当的激发光下观察荧光信号。
荧光信号的形状、位置和强度可以进一步分析目标分子的存在与分布。
免疫荧光染色技术已经广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
例如，在癌症研究中，科研人员可以使用特定的抗体来标记癌细胞中的特定分子，从而了解细胞的染色体构成和蛋白质表达情况。
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免疫组织化学染色步骤
1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次；
2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次；
3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次；
4．正常羊血清封闭，37℃，30 ；
5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次；
6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；
7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；
8．避光显色，显微镜下控制显色时间；
9．0.01M 终止显色；
10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10；
11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤
(1)将组织切片脱蜡入水；
(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；
(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ；
(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次；
(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；
(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）
1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。
手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。
5．去除一抗后，细胞用洗三次。
6．加入二抗，然后加入相对应的孔，在37℃下作用30-60。
洗3次，每次5-10分钟。
7．吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60。
洗3次，每次5-10分钟。
同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的细胞作为阴性对照组。
8．避光显色，显微镜下控制显色时间；
9．终止显色；显微镜下观察拍照。
细胞免疫荧光染色（培养板中染色）
1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。
手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
4．吸尽液体，勿洗，添加一抗，于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，洗3次，每次5-10分钟。
5．去除一抗后，细胞用洗三次。
6．滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；
7．防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
8．荧光显微镜观察拍照。
细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。
染色
1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15→100%酒精Ⅰ、Ⅱ→95%酒精Ⅰ、Ⅱ→80%酒精→70%酒精→50%酒精各1-2。
2．水洗：普通水洗2次，蒸馏水洗1次。
3. 苏木素染色10。
4. 充分水洗：自来水洗10。
5. 盐酸酒精分色：分色10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪去，应着色的部分着色适当。
着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。
6. 充分水洗：自来水洗10。
7. 氨水蓝化2-3。
8. 充分水洗：自来水洗10-15，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。
9. 脱水：70%、80%酒精各1-2。
10. 伊红染色0.5左右，随时镜下观察，染色不宜过深，要与苏木素作对比，要协调鲜明。
11．脱水透明：95%酒精Ⅰ、Ⅱ各1-2→100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15→二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15。
12．中性树胶封片。