免疫荧光-石蜡切片
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）
实验技术：免疫学常用技术之----免疫组化（石蜡切片冰冻切片）免疫组化的原理说起来其实挺简单的，抗原抗体反应嘛，通过采用显色剂来标记抗体，进行化学反应后便能显色，从而确定出组织细胞中的抗原。
可以进行定位、定性以及定量。
石蜡切片或者冰冻切片均可以做免疫组化的实验，前期的过程会有所不同：石蜡切片：取出需要实验的石蜡切片，先进行脱蜡处理，最后置于自来水中备用。
对于冰冻切片，无需上述步骤，直接从-20℃冰箱中取出即可进行后续的操作啦~~~接下来的步骤就全部一样啦~~~抗原修复：由于我们在制备石蜡切片或者冰冻切片时，采用福尔马林进行固定，会使得组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛建，使得不少抗原决定簇被封闭；采用多聚甲醛会具有聚合作用，均阻碍了抗原和抗体的结合。
所以我们怎么着都要进行这步哒，虽然比较耗时。
言归正传，具体的抗原修复液为：0.51 g 柠檬酸钠0.095 g 柠檬酸双蒸水定容至250 mL偷偷告诉你可以偷懒的，配置为10×抗原修复液后，每次实验稀释后使用就可以了。
配置好修复液后，将切片置于其中，采用微波修复法修复（中火，5 min），取出后冷却至室温（一般放在4℃冰箱冷却更快），再进行如上微波修复后冷却，一共三次。
阻断内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢（30%过氧化氢，采用甲醇稀释10倍即可得到）中10 min即可。
随后采用1×PBS洗三次，每次5 min。
抗原抗体反应步骤：这部分内容就会因使用的试剂盒的不同而略有差异了，我使用的是中杉金桥的二步法试剂盒，过程比较简单，接上一步骤后直接加一抗（1×PBS稀释）4℃孵育过夜。
第二天洗一抗（1×PBS洗三次，每次5 min）后加二抗室温孵育半小时后，同上洗三次。
Tips: 有些试剂盒会需要先用血清封闭后再加一抗孵育的。
还有哦，孵育要在湿盒中哦，不然全挥发咯会。
DAB显色：这步挺关键的，显色的时间把握很重要，显色过度会颜色太深而观察不到有效的结果，时间过短也会显色不完全。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片行免疫荧光染色后再行PAS或HE染色确定NPR-A蛋白在肾脏的定位
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究介 绍 一种新 方 法 ， 即采 用 石 蜡 切 片先 行 免 疫 荧 光 染 色 ， 后再 行 过碘 酸雪 夫一 原 染色 （ ＡＳ染 色） 然 糖 Ｐ 或 苏木 素一 红染 色 （ 伊 ＨＥ染 色 ） 明确 ＮＰ — 蛋 白在 ， ＲＡ
大 鼠 肾脏 的组 织 分 布及 细胞 定 位 ， 旨在 为科 研 工 作
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材 料 和 方 法
石蜡切片免疫荧光染色方法完整版
石蜡切片免疫荧光染色方法HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。
具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年⏹70%： 1h-2h⏹80%： 1h-2h⏹90%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹无水Ⅰ：30min-60min⏹无水Ⅱ：30min-60min⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min⏹二甲苯Ⅰ：30min⏹二甲苯Ⅱ：30min⏹石蜡Ⅰ： 1h⏹石蜡Ⅱ： 1h⏹石蜡Ⅲ： 1h包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。
注意事项：1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。
有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。
2、熔蜡温度65 ℃左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。
4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。
5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。
组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。
2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。
石蜡切片照样可以做免疫荧光的
石蜡切片照样可以做免疫荧光的，只不过需要抗原修复，尽量不要用H2O2阻断（据军科院的老教授说会减弱荧光显色）
可以用于免疫荧光的抗体当然可以用于免疫组化，前面的原理都是一样的，只不过二抗一个选的是辣根酶标记的，一个是荧光素标记的，当然免疫组化跟免疫荧光所需的条件不同，需要重新摸索适当的浓度比例如果免疫荧光做出来了，说明一抗可以和目的蛋白结合，二抗跟一抗结合也没问题，那么免疫组化做不出就可以怀疑是二抗问题了
当然还有一个极端情况，就是免疫荧光看到的就不是目的蛋白而是自发荧光，那么就是一抗问题了。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
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石蜡切片免疫荧光操作规程
试剂
1)二甲苯
2)PBS缓冲液
3)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
4)goat血清
5)一抗稀释液： 3%BSA in TBS，pH7.4
操作流程
1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；
2）无水乙醇中浸泡5min；
3）95%乙醇中浸泡5min；
4）70%乙醇中浸泡5min；
2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。
℃小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者371
7.PBS洗3次每次5min。
8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。
）
9.PBS洗3次每次5min。
10. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染色10min。
11. PBS洗3次每次2 min。
12.封片： Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。