蛋白质印迹法
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法经过几十年的发展，已经成为一种重要的生物分析技术，被广泛用于分析生物样品中蛋白质的组成和表达。
蛋白质印迹法可以快速、灵敏地检测出蛋白质的组成、表达和结构，有效地支持研究者完成生物科学研究，让研究者能够更全面地理解蛋白质的功能和作用机制。
蛋白质印迹法有多种方式，其中最常用的有电泳（SDS-PAGE）、蛋白凝胶印迹（2D-PAGE）、质谱印迹（MALDI-TOF）、重链接蛋白凝胶印迹（RCM-PAGE）、以及同步层析分离法（2D-LC/MS）。
电泳是蛋白质印迹中最常用的技术之一。
它使用一种叫做十二烷基硫酸钠（SDS）和变性剂的全蛋白溶液。
电泳可以指示蛋白质的分子量和结构。
通常，蛋白质溶液经过凝胶定性和定量分析。
蛋白凝胶印迹（2D-PAGE）是一种多维度的方法，可以用来分析蛋白质的复杂性和表达量。
2D-PAGE的基本原理是先将蛋白质溶液通过氨基酸印迹法定量分析，然后再将蛋白质分离出来，最后再通过电泳法进行定量分析。
质谱印迹（MALDI-TOF）是一种分析蛋白质的快速测试技术。
通过这项技术，研究者可以分析蛋白质的分子量、肽段结构和三维结构。
同时，MALDI-TOF也可以用来检测不同样品中的蛋白质表达量，增强蛋白质分析的准确性。
重链接蛋白凝胶印迹（RCM-PAGE）是一种分析蛋白质结构和电性特性的方法。
这个方法可以用来分析蛋白质的可解离结构，让研究者可以从样品中获得有关蛋白质结构和功能的全面信息。
最后，2D-LC/MS是一种结合了质谱印迹和液相色谱的技术，它可以同时对蛋白质的结构和表达量进行定量分析。
2D-LC/MS的优点是它可以快速准确地检测出蛋白质的结构，从而可以有效地支持蛋白质功能和作用机制的研究。
蛋白质印迹法是一种非常有用的研究工具，它可以有效地帮助研究者了解蛋白质的组成和表达，而且还可以帮助研究者分析蛋白质的结构和功能。
在研究蛋白质功能和作用机制方面，蛋白质印迹法已经发挥了重要作用。
蛋白质印迹法
蛋白质印迹法蛋白质印迹法是一种用于检测和分析蛋白质的测定技术，它利用一种蛋白质示踪实验技术来检测和识别由有机物和分子质量谱检测的蛋白质的形状和结构。
蛋白质印迹法有助于研究蛋白质的功能、结构以及与其他分子的相互作用。
同时，它也有助于研究蛋白质在不同蛋白质组中的分子量和拷贝数，这在病理检测和基因检测中显得尤为重要。
蛋白质印迹法的工作原理：将受检的样品经由溶解、平衡和均质化处理后，将其涂布于特定的固定底物上，经过一定的温度、湿度和时间条件处理，以促进蛋白质印迹法中反应过程的完成。
随着温度、时间和湿度的改变，蛋白质示踪实验有助于检测和分析样品中的蛋白质。
在这一过程中，检测过程中分子可以在特定位置上形成印迹，基于它们在溶剂移动性、分子量和电荷的不同，就可以根据它们的印迹来分析出蛋白质的分子结构。
在蛋白质印迹法的分析过程中，也可以用蛋白质印迹来研究蛋白质的相互作用。
通过将“特定的蛋白质”与试剂混合，就可以分析出蛋白质与混合试剂之间的结合情况，从而研究蛋白质之间的相互作用。
此外，也可用蛋白质印迹法来研究蛋白质的表达和分布。
在这个过程中，实验者可以根据蛋白质的印迹图精确比较图像中的蛋白质的表达和分布，从而得出它们之间的表达量、分布和相互作用的结果。
蛋白质印迹法作为一种快速、准确、高效的检测技术，是基础生物学、分子生物学和病理学研究的重要工具，在今天被广泛用于科学研究中。
目前，蛋白质印迹法已经在许多生物学和医学领域中得到了广泛应用，如分子遗传学、发育生物学、免疫学、蛋白质组学等。
总之，蛋白质印迹法是一种非常重要的技术，它有助于深入探索蛋白质的结构和功能，并为免疫学、分子遗传学及其他应用领域提供了有用的信息。
未来的研究将注重于进一步优化蛋白质印迹法的技术条件，以及开发新型的示踪试剂、检测方法和技术，以获得更加精确的结果。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
蛋白质印迹分析-WesternBlotanalysis
实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化, 另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体(一抗) 与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻” 而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上, 我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10 分钟~30 分钟。
2. 湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45 分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I 标记系统。
【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜 ( Millipore Immobion-P #IPVH 000 10 ); Whatman 3MM纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
蛋白质印迹法WesternBlot技术
电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
（1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白 标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制 25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用， 也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
一抗杂交
一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。 将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。
蛋白质印迹法
分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种： i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底 物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化 物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
其他信息
值得一提的是，Western Blot这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Edwin Southern 的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern Blot。后来出现了两个过程相似，但是对象不同 的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，人们把这两种技术分别称为Northern Blot（由斯坦福大学的 George Stark发明）和Western Blot。这两个技术的命名与发明人的名字没有关系了。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
结果分析
可能出现的问题如下。 1．背景过高 ①封闭不充分，应更换封闭液或延长封闭时间； ②抗体浓度过高，应适当增加抗体稀释倍数； ③洗膜不充分，应增加洗涤次数或洗涤时间； ④膜质量较差，应选择高质量的NC膜，并且整个实验过程中保持膜的湿润。 2．没有阳性条带或条带很弱 ①目的蛋白质未充分转移到膜上或洗膜过度，应使用丽春红S染色以检查转膜效果，或减少洗膜次数，缩短洗 膜时间； ②抗体不匹配或一抗过期或一抗不能识别变性或还原的蛋白质，应注意选择特异性的抗体并在有效期内使用， 或改用非变性凝胶系统； ③抗体浓度低，应适当增加抗体浓度，或延长孵育时间；
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白印迹法（Western-blot）一、基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。
已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。
其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。
本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。
WB的原理如下。
Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分离蛋白质。
SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。
无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。
同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。
另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和ß-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。
分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。
用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。
能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。
为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。
二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。
二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。
二、器材电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml）三、试剂配制：1）、1.5M Tris—Hcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4℃保存。
2）、1.0M Tris—Hcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4℃保存。
3)、10％SDS：10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水至100 ml。
4）、10×TBS（Tris buffer solution）, pH7.6：24.2g Tris，80g NaCl, 溶于700 ml ddH2O 用1M HCl（约15 ml）调节pH至7.6，加ddH2O 至1000 ml。
5）、TBS-T，pH7.6：前述TBS-T加Tween-20使浓度为0.1％。
6）、5×电泳缓冲液，pH8.3：15g Tris, 72g甘氨酸，5g SDS 溶于1000 ml ddH2O，4℃保存。
（若有沉淀出现，用前加热至室温即可）。
7）、转移缓冲液（25mM Tris、192 mM甘氨酸、20％甲醇），pH8.3：3.03 g Tris，14.4 g 甘氨酸，200 ml甲醇加ddH2O至1000 ml。
（勿用酸碱调节pH）。
8）、10mM PMSF液；异丙醇8 ml，PMSF0.01742 g溶解后定容至10 ml。
（使用时按照10 ml裂解液：1 ml 10mM PMSF）9）、裂解缓冲掖；包含50mmol/L Tris.HCl(Ph8.0),150mmol/L NaCl,1％TritonX:配置100ml的裂解缓冲掖，需称取Tris碱0.61g溶解于60ml 双蒸水，用浓盐酸调节Ph8.0，然后加入NaCl0.88g,TritonX—100 1ml,加水至总量为100ml。
10）、PBS 800ml 蒸馏水中加入NaCl18g，KCl0.2g,Na2HPO4 1.44g和KH2PO4 0.24g,用浓盐酸调节Ph至7.4，定容至1L。
高压灭菌。
11）、10％过硫酸胺（APS）：称取APS 0.5g溶解于5ml ddH2O中，分装保存于—20℃。
12）、1％溴酚蓝: 称取0.1 g溴酚蓝溶解于10 ml ddH2O中,分装保存于4℃。
13）30%丙烯酰胺（Acr:Bis=29:1）:称取丙烯酰胺（Acr）29g,甲叉丙烯酰胺（Bis）1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4℃保存，可用1个月13）、Sample Buffer:总体积8.0 mlddH2O 3 .8 ml0.5M Tris—Hcl 1.0 ml甘油0.8 ml10％SDS 1.6 mlß-巯基乙醇0.4 ml1％溴酚蓝0.4 ml实验步骤：1、样品制备：小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重↓按1g组织中加入冰预冷的10 ml裂解液，10mM PMSF 1ml 冰上制成10％的组织匀浆↓取1ml匀浆20000g，4℃、离心30分钟↓小心吸取上清液↓取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20℃保存备用2、蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）考马斯亮蓝G—250 是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G—250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595 nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
按下表操作。
表1加入物空白管测定管PBS 150μl 145μl考马斯亮蓝染液 2.85ml 2.85ml蛋白质提取液－ 5μl摇匀，室温放置5分钟，空白调零，于595nm处比色绘制标准曲线，计算测定管的浓度3、制胶：装配好制胶玻璃板↓按下列配方配制12％的分离胶：12％的凝胶溶液成分体积（总体积10 ml）ddH2O 3.3 ml30％丙烯酰胺溶液 4 ml1.5M Tris （Ph8.8）2.5 ml10％SDS 100µl10％过硫酸胺（APS）100µlTEMED 4µl将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。
↓将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡，聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液。
↓按下列配方配制5％的聚集胶：5％的凝胶溶液成分体积（总体积5 ml）ddH2O 3.4 ml30％丙烯酰胺溶液 0.83 ml1.0M Tris （Ph6.8） 0.63 ml10％SDS 50µl10％过硫酸胺（APS）50µlTEMED 5µl将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。
↓注入聚集胶前，用滤纸吸干分离胶上的水。
缓慢注入聚集胶，过程中注意防止产生气泡。
插入梳齿，聚胶30分钟后小心拔除梳齿。
↓用ddH2O清洗梳孔，放入电泳槽备用。
4、样品处理：用Sample Buffer 按1：1稀释样品↓95℃加热变性5分钟5、上样及电泳：将电泳槽内注满1×电泳缓冲液，彻底除去点样孔中和胶底的气泡。
↓两边空白的泳道点上等量的Sample Buffer ，上样量（20µl含40µg蛋白）↓向电泳外槽内注入1×电泳缓冲液，盖上盖子，电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，稳压，当染料抵达分离胶底部约80分钟，断开电源。
6、转膜：剪6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶相同↓将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟，除去气泡。
↓凝胶电泳完成后取出。
按照海绵→3块滤纸→凝胶→NC膜→另外3块滤纸→海绵的顺序依次放，应避免气泡。
↓用塑料支架夹紧上述各层，放入转移内槽及外槽，注入冰预冷的转移缓冲液。
注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。
↓转移200mA稳流，4℃，1.5小时。
7、封闭NC膜：转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分钟。
↓用western blotting封闭液封闭NC膜，室温下振荡1小时后4℃过夜（NC膜正面向上）8、一抗结合:一抗用封闭液配制（按1：20（CYP1A1）及1:200(β-actin)配制）↓室温振摇2小时（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟9、二抗结合：二抗以TBS-T稀释（按1：600配制）↓室温振摇孵育1.5小时（NC膜正面向上）↓以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟10、显色：辣根过氧化物酶显色1）在试管中先加入1ml×HRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500µl、试剂B500µl、C500µl混匀即可。
2）配制好的溶液应避光存放，30min内使用，染色为褐色。
3）室温下染色时间为5～30min，可根据颜色变化掌握染色时间。
4）等目的条带显色后，用少量PBS清洗。
11、照相保存（附：CYP1A1的分子量为56Kda，β-actin的分子量为43Kda）2011年研究生高级生化实验（WB）实验记录姓名年月日教师签字2011年研究生高级生化实验（WB）实验记录姓名年月日教师签字2011年研究生高级生化实验（WB）实验记录姓名年月日教师签字（此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容，供参考，感谢您的配合和支持）。